Synthesis and characterization of aromatic group-cored amphiphiles for membrane protein study

Abstract

막단백질은 생물학적 분자와 이온의 수송, 세포 내 신호 전달 그리고 인간 약물의 주요 표적을 포함하는 광범위한 세포 과정에 직접적으로 연관되어 있기에 세포 생리학에 있어 매우 중요하다. 이러한 생체 거대 분자는 수용성 단백질보다 연구하기가 어려운데 왜냐하면 막단백질은 상대적으로 불안정해서 일단 자연 상태의 막에서 추출되면 그들의 온전한 구조와 기능을 상실하기 때문이다. 그런 이유로 작용 기전을 근본적으로 이해하고 약물 분자를 합리적으로 설계하기 위해 이들 단백질의 구조 및 기능에 큰 관심을 가지고 있다. 막단백질은 자연적으로 낮은 수준으로 존재하고, 재조합 과발현에 어려움을 겪고 있으며, 일단 자연 상태의 지질 이중층으로부터 추출되면 제한된 안정성을 보이기 때문에, 이들의 추출, 정제 및 생체 외 검사는 큰 도전으로 남아있다. 막단백질의 분리 및 구조 연구에서 핵심적인 요구 사항은 소수성 단백질 표면을 보호하는 양친매성 첨가제를 이용하여 극성 수성 환경으로부터 막단백질이 유지되어야 한다는 것이다. 양친매성 분자는 세포막으로부터 막단백질을 추출하고 이를 다운 스트림 분석 동안 안정한 형태로 유지하기 위해 널리 사용되는 양쪽성 화합물이다. 그러나, 기존 양친매성 분자의 특성이 제한되어 있기 때문에 막단백질 연구를 진행시키기 위해서는 단백질 안정성을 위한 최적의 특성을 갖는 새로운 양친매성 물질을 개발하는 것은 필수적이다. 이 논문에서는 기존 양친매성 분자와는 다른 구조를 가진 몇 가지 새로운 종류의 양친매성 분자 종류들이 소개될 것이다. 생화학적 도구로서의 유용성에 접근하기 위해, 이 물질들을 다양한 막단백질에 대한 추출 및 안정화 능력에 대한 평가를 진행하였다. 우리는 두개의 알킬 사슬과 1,3,5-triazine-중심구조의 maltosides (TEMs 및 TSMs)로 지정된 분지된 디말토사이드 헤드 그룹을 가진 1,3,5-triazine-중심 양친매성 분자 두 세트를 설계하고 합성하였다. 각각의 세트는 말토사이드 헤드 그룹과 1,3,5-트리아진 고리를 연결하는데 사용되는 링커로서 각각세리놀(Serinol) 또는 디에탄올아민(Diethanolamine)을 사용하였다. 우리는 이 물질들을 다양한 모델의 막단백질을 이용하여 평가하였고, 단백질의 추출 및 안정화 능력에 대하여 DDM과 비교하였다. 이 연구는 DDM과 비교하여 다양한 막단백질에서 현저하게 향상된 안정성을 갖는 여러 유망한 양친매성 분자, 특히 TEM-E10 및 TEM-T9를 확인하였다. TEM-Ts에 의해 향상된 단백질 안정화 효능을 바탕으로 기본구조에서말토오스에서 글루코즈로 헤드 그룹을 교체함으로써 TEM-Ts의 유사체를 설계 및 제조하였다. 여기서 세리놀 또는 디에탄올아민 링커 대신에 새로운 링커인 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄 (TRIS)을 사용하여 소수성 부분을 친수성 부분과 연결하였다. 이 종류의 양친매성 물질은 이전 버전 (TEMs/TSMs)과 비교하여 물리적 특성의 차이를 보여줄 뿐만 아니라 평가된 막단백질에 대해 상당한 우수성을 나타냈다. 모든 TTG-Ts는 모델 막단백질 안정화에서 DDM보다 더 효과적이었다. 모든 시험된 분자 중에서, 특히 TTG-T11은 막단백질인 LeuT, MelBSt 및 β2AR 안정성에 대하여 최고의 성능을 가졌다. 다음 연구에서 우리는 두 개의 트리아진 단위를 연결하는데 사용되는 링커에 따라 세 가지 하위 클래스로 나눌 수 있는 양친매성 분자들을 합성하였다. 이들 양친매성 물질은 두개의 알킬 사슬 및 말토오스 헤드 그룹을 갖는 두개의 트리아진 단위가 3가지 다른 링커를 사용하여 서로 연결되도록 설계하였다: 에틸렌디아민 (TZM-Es), 히드라진 (TZM-Hs) 및 레조르시놀 (TZM- Rs). TZM-Es 및 TZM-Hs는 막단백질 안정화에 대해 서로 대등하였으며, 이 새로운 분자들은 DDM보다 우수하였다. TZM-Rs가 일반적으로 DDM보다 우수하였지만, 헤드 그룹의 높은 친수성으로 인해 단백질 안정화에서 다른 세트보다 더 나빴다. 막단백질 분석을 위한 새로운 종류의 양친매성 분자에 대하여, 우리는 디알콕시벤젠에서 유도된 글루코사이드 및 말토사이드 (ABGs 및 ABMs/Ms) 양친매체들을 계속 합성하였다. 이들 양친매체는 일반적으로 소수성기로 2개의 알킬 사슬을 가지고 친수성기로 4개의 글루코즈 또는 2개의 말토사이드를 가지고 있다. 중앙 벤젠 코어 주위의 두 알킬 사슬 또는 헤드 그룹의 상대적인 위치를 변경함으로써 헤드 그룹과 꼬리 부분 사이의 분리 정도가 다른 새로운 양친매성 분자를 준비할 수 있었다. 이렇게 함으로써, 양친매성 분자의 소수성기로부터 분리된 친수성기의 단백질 안정화에 대한 효능을 평가할 수 있다. 모든 합성된 양친매성 분자는 물리적으로 특징지어졌고, 다수의 막단백질에 대한 이 클래스 양친매성 분자의 유용성 평가가 진행 중이다.|Membrane proteins are crucial for cellular physiology as they are directly involved in a large spectrum of cellular processes including transport of biological molecules and ions, intracellular signal transduction and are major human drug targets. These bio-macromolecules are difficult to study than soluble proteins because they are relatively unstable, often losing both structural and functional integrity, once extracted from the native membranes. Accordingly, there is great interest in the structure and function of these proteins in order to both fundamentally understand mechanism of action and to rationally design drug molecules. Their extraction, purification, and in vitro investigation remain challenging largely because these biological entities are present in low levels naturally, are challenging to recombinant overexpress and exhibit limited stability once extracted from the native lipid bilayers. A key requirement in the isolation and structural study of membrane proteins is that they must be maintained in solution by amphipathic additives that shield the large hydrophobic protein surfaces from the polar aqueous environment. Detergents are amphiphilic compounds widely used to extract membrane proteins from the native membranes and maintain them in a stable form during downstream analysis. However, due to limited properties of conventional detergents, it is essential to develop novel amphiphiles with optimal properties for protein stability in order to advance membrane protein research. In this thesis several novel classes of amphiphiles having distinct architecture from conventional detergents will be introduced. To investigate their utilities as biochemical tools, these agents were evaluated for solubilization and stabilization of a diverse set of membrane proteins. We have first designed and synthesized two sets of 1,3,5-triazine-cored detergents with two alkyl chains and a branched dimaltoside head group, designated 1,3,5-triazine-cored maltosides (TEMs and TSMs). Each set contains either serinol or diethanolamine as a linker used to connect the maltoside head group with the 1,3,5-triazine ring. These agents were evaluated with several model membrane proteins and their efficacies were compared with DDM in terms of protein solubilization and stabilization. This study identified several promising detergents, particularly TEM-E10 and TEM-T9, that endow a range of membrane proteins with markedly enhanced stability compared to DDM. Enhanced protein stabilization efficacy conferred by the TEM-Ts, especially TEM-T9, provoked us to prepare their analogs by changing the head group from maltose to glucose. Here a rigid linker, tris(hydoxymethyl)aminomethane (TRIS), was used to connect the 1,3,5-triazine-core with the glucoside-based hydrophilic group instead of the serinol or diethanolamine linker. This class of amphiphiles, designated TTG-Ts, not only displayed differences in physical properties in solution as compared to the previous version (TEMs/TSMs), but also showed a profound effectiveness with the tested membrane proteins despite the presence of the glucoside head group. All TTG-Ts were more effective than DDM at stabilizing model membrane proteins. Among all tested agents, TTG-T11 was the best performer for LeuT, MelBSt and β2AR stability. In next study we have synthesized a class of amphiphiles that can be divided into three subclasses according to a linker used to connect two triazine units. These amphiphiles were designed in such a way that two triazine units, possessing two alkyl chains and maltose head groups, were connected to each other using three different linkers: ethylenediamine (TZM-Es), hydrazine (TZM-Hs) and resorcinol (TZM-Rs). The TZM-Es and TZM-Hs were comparable to each other for membrane protein stabilization and these new agents were superior to DDM. In the case of the TZM-Rs, there agents were generally better than DDM, but were worse than the other sets for protein stabilization, mainly due to high hydrophilicity of the head group. As for another new class of detergents for membrane protein analysis, we continued to synthesize dialkoxybenzene-derived glycoside (ABGs) amphiphiles. These amphiphiles commonly bear two alkyl chains as the hydrophobic groups and four glucose or two maltosides as the hydrophilic groups. By varying the relative locations of the two alkyl chains or head groups around the central benzene core, we could prepare the new detergents with different degree of segregation between the head group and tail groups. By doing so, we can evaluate detergent efficacy for protein stabilization in terms of segregation of detergent hydrophilic group from the hydrophobic group. All the synthesized amphiphiles were physically characterized and utility of these amphiphiles with multiple membrane proteins is in progress.