M2 대식세포에서 분비하는 세포외소포체를 이용한 대식세포의 적혈구 생성에 대한 효과 연구

Abstract

세포외소포체(extracellular vesicles; EV)는 대부분의 세포에서 방출되는 나노 사이즈(30-500 nm)의 입자로서 세포간 신호전달에 필요한 생체 활성 분자(단백질, miRNA, mRNA, 지질 등)를 포함하고 있다. 중간엽 줄기 세포에서 분리한 세포 외소포체는 혈관 신생, 세포 증식 및 신경 이동을 향상시키는 것으로 나타났다. 조혈줄기세포 유래 세포외소포체는 성장인자를 포함하고 신호전달을 유지하여 생쥐 배아 줄기세포로부터 조혈 분화를 촉진시킨다는 보고가 있으며, 조혈줄기세포의 분화과정에서 miRNA를 포함하는 세포외소포체는 전구 세포의 분화를 조절한다. 하지만, 적혈구 전구세포에서 세포외소포체가 들어갈 수 있는지, 어떤 영향을 미치는지 여부에 대해서는 연구된 바 없다. 한편, 골수 내 적혈구모세포섬(erythroblastic island)에서 대식세포와 적혈구전구세포 간의 상호작용이 적혈구생성과정(erythropoiesis)에 중요하다고 알려져 있지만, 그 기전은 명확히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 적혈구모세포섬의 대식세포에서 분비되는 세포외소포체를 통해 적혈구전구세포의 증식 혹은 분화에 영향을 미치는지 규명하고자 한다. 세포외소포체는 인간 대식세포주(THP-1 세포)로부터 적혈구모세포섬에서의 대식세포 표현형 M2로 분화를 확인한 후, 배양액에서 분리하여 그 특성을 분석하였다. 그리고 농도별로 배양배지에 처리하여, 증식 혹은 분화중인 적혈구전구세포에 대한 효과를 비교분석하였다. 세포외소포체를 배지에 처리한 후 confocal laser scanning microscopy로 관찰하여, 최초로 적혈구전구세포 cytoplasm으로 세포외소포체가 직접 함입된 것을 확인하였다. 적혈구전구세포를 증식배지에서 30일 간 배양하면서 세포외소포체를 농도별로 처리한 결과, 모든 세포외소포체의 처리농도에서 viability는 비슷하였지만, 처리농도가 높을수록 점진적인 세포 증식의 감소와 세포 응집현상(aggregation)이 나타났다. 세포외소포체의 처리 후 적혈구전구세포의 cell adhesion molecule의 발현 변화를 RT-qPCR로 분석한 결과, 2 × 103 EV/cell을 72시간 처리 시 접착 분자인Intercellular Adhesion Molecule 4 (ICAM4) 및 적혈구계세포 특이적 유전자인, Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein (AHSP)의 발현이 증가하였다. 세포외소포체를 처리한 후 적혈구 분화배지에서 배양하며 flow cytometry로 분석한 결과, 분화 4일 째에 glycophorin A와 CD71의 발현이 세포외소포체를 처리한 실험군에서 향상되어 분화를 촉진함을 알 수 있었다. 그리고, 세포외소포체 처리군에서는 탈핵 직전단계인 orthochromatic erythrocyte까지의 분화 비율이 증가하였으며 nuclei condensation, cytoplasm이 안정적으로 성숙되었다. 그러나, 성숙적혈구에서 발현이 감소하는 CD49d는 큰 차이를 보이지 않았고 탈핵 비율 자체는 차이가 없었다. 결론적으로, 대식세포 유래 세포외소포체는 적혈구전구세포 내로 이입되어 orthochromatic erythrocyte까지 분화를 효과적으로 유도하여서, 대식세포가 적혈구생성과정을 조절하는 방법 중 하나임을 최초로 규명하였다. 본 연구는 향후 골수 대식세포의 기능이 저하된 질환의 세포치료제로서의 접근 가능성과 적혈구를 체외에서 생산시 성숙을 조절하는 한 방법으로서 대식세포 유래 세포외소포체의 이용 가능성을 시사한다.