Redox Mediated Electrochemical Monitoring of Slow Horseradish Peroxidase Second-Order Kinetics in Galvanic Cell

Abstract

Horseradish peroxidase (HRP) is a monomeric heme containing enzyme that catalyzes the oxidation of a redox substrate in the presence of hydrogen peroxide (H_2 O_2). In this thesis, a classical metallic indicator electrode approach in a galvanic cell was revisited to directly interrogate ‘slow’ oxidative conversion reaction between HRP and redox substrates. In addition, the presented electroanalysis was able to recognize inhibited reactivity of HRP for FcMeOH-oxidation by its conjugation to the model proteins (streptavidin, avidin, and monoclonal antibody), whereas such effect was negligible for H2Q-oxidation by HRP. Through theoretical investigation, electroanalysis in galvanic cell showed lower detection limit for recognition of an apparent rate constant for oxidative conversion of a redox substrate by HRP than electrolytic cell. Direct interrogation of the rate of the redox reaction between HRP and redox substrate was possible by monitoring a transient current responses associated with the electrode-reduction of an oxidized form of a redox substrate. Therefore, selection of electrochemically stable redox mediator which reflects the enzymatic redox activity of HRP is critical. Five redox substrates (ferrocyanide ([Fe(CN)6]4-), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), tetramethylbenzidine (TMB), H2Q, and FcMeOH) were electrochemically tested, and FcMeOH and H_2 Q were selected as a suitable redox substrate due to its electrochemical reversibility and oxidative reactivity with HRP but negligible side reactions with hydrogen peroxide. From the chronoamperometry study, the apparent rate constant for the oxidative conversion of FcMeOH was estimated, and it was two orders magnitude lower than that of H_2 Q. The molecular docking simulation revealed that the access of FcMeOH to the heme site of HRP was difficult due to its steric bulkiness, which leads to the conformational change of HRP and eventually lowers the rate constant. On the other hand, the conformational change of HRP was negligible for the access of the H_2 Q to the heme site. This computational result infers that the redox activity of FcMeOH might be more sensitive to recognize the conformation change of HRP rather than H_2 Q. The kf,Redox of FcMeOH by the HRP-streptavidin conjugate was estimated to be ~5 times smaller than that by free HRP, and those by other conjugated to avidin and monoclonal antibody were ~60 % of that by the non-conjugated one. However, the kf,Redox of H_2 Q by HRP was barely affected by streptavidin, avidin and monoclonal antibody. These electrochemical results indicate that the redox activity of HRP can be affected by conjugated proteins when an access of a redox substrate to a catalytic site of enzyme induce a conformational change of the enzyme. Since this analytical approach observed the slow kinetics of HRP and the effects of the conjugated proteins on redox activities of target enzyme, this thesis believe the presented electroanalysis would effectively provide fundamental insight to HRP based bioassays. |겨자무과산화효소, Horesradish Peroxidase (HRP)는 헴 그룹을 통해 과산화수소를 환원시키며 얻은 산화력으로 다양한 유기 기질들을 산화 시키는 반응기작을 가지고 있는 과산화효소이다. 본 분석법은 갈바니 전지에서 금속 지시 전극법을 사용하여 HRP와 산화환원기질 사이의 느린 반응 속도를 관찰하였다. 뿐만 아니라, 본 분석법을 통하여 HRP가 타 단백질에 결합 되어있을 때 페로센 메탄올을 산화시키는 속도가 유리 HRP에서의 속도보다 느리지만, 하이드로퀴논에서는 둘 간의 차이가 발생하지 않는다는 결과도 얻게 되었다. 본 학위논문에서는 HRP의 활성을 저농도 상황에서 분석하기 위해, 느린 반응 속도를 가진 반응에 대한 분석이 용이한 전기화학적 방법을 모색하였다. 컴솔 시뮬레이션을 통해 전해 전지에서보다 갈바니 전지에서 전기분석을 하는 것이 느린 반응 속도 상수를 가진 반응에 대한 분석에 더 용이함을 확인하였다. 용액 상 HRP에 의해서 산화된 산화환원기질을 전극에서 환원 시켜 발생하는 전류를 통해, HRP와 산화환원 기질 사이의 반응속도에 대한 직접적인 관찰을 하고자 하였다. 따라서 HRP의 효소적 산화환원 활성을 반영하는 전기화학적으로 안정한 산화환원 매개체의 선택이 중요하다. 때문에 다섯 가지 기질에 대한 적합성 평가를 수행하였고, 페로센메탄올과 하이드로퀴논이 전기화학적으로 가역적이고, 과산화수소와의 부반응이 없으며, HRP에 의해 산화되는 특성을 가지고 있기 때문에 가장 이상적인 기질로 선택되었다. 시간대 전류법을 통해 페로센메탄올과 하이드로퀴논의 유리 HRP와의 산화환원 활성을 측정하였고, 페로센메탄올에서의 산화환원 활성이 하이드로퀴논 에서보다 약 100배 정도 낮았다. 분자 도킹 시뮬레이션을 통해 페로센메탄올에서의 낮은 활성은 기질 자체의 입체부피에 의해 HRP의 활성부위로의 접근이 어려워짐에 따라 유도되는 HRP의 구조변화에 기인한다는 것을 증명하였다. 반면, 하이드로퀴논의 접근은 HRP의 구조적 변화를 유도하지 않았다. 이 계산 결과를 통해, 페로센메탄올의 산화환원 활성이 하이드로퀴논보다 HRP의 구조변화를 인식하기 더 좋은 지표임을 알 수 있었다. 마지막으로, HRP-단백질 결합체의 활성에 대해 알아보기 위해 HRP-스트렙타비딘, HRP-아비딘, HRP-단일클론항체에 대한 산화환원 활성을 페로센 메탄올과 하이드로퀴논을 통해 측정하였다. HRP-단백질 결합체의 활성이 유리 HRP보다 각각 90%, 30%, 40% 감소한다는 것을 실험적으로 입증하였다. 하지만, 하이드로퀴논에서의 HRP-단백질 결합체들의 활성은 유리 HRP에서의 활성과 유사 하였다. 이러한 전기화학적 측정을 통해 본 논문에서는 기질이 효소의 활성부위로의 접근이 효소의 구조변화를 유도할 때, 효소의 활성이 결합된 단백질에 의해 감소할 수 있음을 나타낸다. 본 분석법은 HRP의 느린 반응속도 및 단백질이 효소의 반응성에 미치는 영향을 관찰했기 때문에, 이 연구가 HRP 기반 생물분석에 대한 근본적인 이해를 효과적으로 제공할 수 있기를 기대 한다.