펩타이드 리간드와 과산화효소 매개 형광신호 증폭법을 이용한 암세포 표적이미징

Abstract

암세포를 표적하는 형광이미징 (fluorescence imaging)은 암세포의 추적 및 표적치료에 널리 활용되어 왔으나 대부분 항체에 의존한 이미징 방법에 국한되어왔고, 수용체 혹은 이를 표적하는 리간드 분자의 농도가 낮을 경우 리간드-형광체를 사용하는 기존 형광이미징 분석법으로는 암세포 특이적 분별에 한계를 보여왔다. 이를 해결하기 위해, 본 연구에서는 수용체를 표적하는 리드 펩타이드 (lead peptide, LP)와 과산화효소 (peroxidase)에 의한 형광신호 증폭법 (peroxidase-accelerated signal enhancement)을 제안한다. 제안한 표적 이미징은 다양한 암세포주에 과발현되어 있는 것으로 알려진 integrin beta1 (ITGB1) 수용체를 표적하는 펩타이드 리간드와 peroxidase간의 직접 혹은 간접 결합을 통해 암세포 수용체 주변에서 peroxidase에 의한 기질 반응을 촉진시킴으로써 형광신호를 수십 혹은 수백 배 증폭할 수 있는 원리이다. 이를 구현하기 위해, 본 연구에서는 horseradish peroxidase (HRP)와 soybean ascorbate peroxidase 2 (APEX2)를 사용하였고, 두 종류의 과산화효소는 과산화수소 (H2O2) 농도 조건에서 도파민 (dopamine) 혹은 바이오틴 페놀 (biotin-phenol) 대해 서로 다른 산화반응력을 보여주었다. 이를 바탕으로 첫번째는 HRP에 기반한 형광신호증폭방법을 ITGB1이 과발현된 유방암 세포주 (MCF-7)에서 수행하였다. 바이오틴 (biotin)이 부착된 펩타이드 (biotin-LP) 리간드를 처리 후 뉴트라아비딘 (neutravidin, NA)이 부착된 NA-HRP와의 결합을 유도하였을 때 MCF-7 세포막에서 과산화수소와 도파민 (dopamine)을 빠르게 산화시켜 폴리도파민 (polydopamine)의 광범위한 침전 반응을 유도하였고, 폴리도파민에 강하게 흡착될 수 있는 아민기 (amine group) 표지 형광나노입자를 처리하여 신호 증폭을 관찰하였다. 이는 기존 형광체 결합 펩타이드에 비해 약 1000배 이상의 신호 증폭 결과를 보여주었다. 두번째는 APEX2에 기반한 형광신호 증폭 방법으로서, 펩타이드 리간드에 APEX2가 결합된 재조합 단백질 (APEX2-LP)을 이용하여 MCF-7 세포주를 이미징하였다. 고농도의 과산화수소 조건과 세포 고정 (cell fixation)이 요구되는 HRP-도파민 반응과는 달리, APEX2는 살아있는 세포에서 저농도의 과산화수소와 바이오틴 페놀 기질을 빠르게 산화시켜 표적 수용체 및 수용체 주변 단백질의 바이오티닐화 (biotinylation) 반응을 유도하였다. 그 결과 살아있는 세포에서 streptavidin-Cy3 (SA-Cy3)를 처리 시 형광신호가 기존 형광체에 비해 약 10배이상 증폭되는 효과를 관찰하였다. 또한 APEX2에 의한 방법은 암세포막 수용체 및 주변 단백질을 근접 표지법 (proximity labeling)으로 확인할 수 있는 가능성을 보여주었다. 결론적으로, 본 연구에서 수행된 과산화효소에 의한 형광신호 증폭법은 세포 및 생체 조직 내 다양한 바이오마커 분자에 대한 효과적인 표적이미징과 리간드를 이용한 신규 수용체 스크리닝에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대한다.|Cancer cell fluorescence imaging with high sensitivity is required for cancer prognosis and therapy. However, conventional fluorescence (FL) imaging by fluorophore-labeled probes lacks sensitivity when expression level of targeted receptor of the cancer cell is not enough to detect. Here, I present peroxide-accelerated signal enhancement methods which utilizes horseradish peroxide (HRP) and soybean ascorbate peroxidase 2 (APEX2). The two method were tested with MCF-7 and Lead peptide which is known to target integrin beta 1(ITGB1) overexpressed in some breast cancer cell lines. HRP-enhanced FL imaging is accomplished by dopamine polymerization by HRP bound to the target cell via biotin-labeled peptide followed by amine-functionalized quantum dot deposition. This method resulted in about 100 fold enhanced sensitivity than conventional method. APEX2-enhanced-FL imaging method showed 10 fold increased sensitivity than conventional method by rapid biotinylation by APEX2 fused to the peptide and streptavidin-Cy3 binding. Sensitivity of HRP-accelerated signal enhancement method was higher than APEX-based while APEX2 while it required cell fixation due to long reaction time and high hydrogen peroxide concentration. I suggest that this approach can be used as a signal amplification platform for peptide-based FL imaging and be useful for peptide target molecule screening.