포밀트랜스퍼라제 Fmt1의 Saccharomyces cerevisiae 세포 내 위치 변화와 세포질 단백질의 N-말단 포밀화 연구

Abstract

Bacteria and eukaryotic organelles such as mitochondria and chloroplast use N-terminally formylated methionine (Nt-fMet) for the initiation of protein synthesis. The methionine covalently attached to Met-tRNAi is pretranslationally formylated at its N-terminus by formyltransferases (FMTs) using 10-formyltetrahydrofolate (10-fTHF) as a cosubstrate. Thus, virtually all nascent proteins from ribosomes of bacteria, mitochondria, and chloroplast are N-terminally formylated (Nt-formylated). The N-terminal formylation (Nt-formylation) of proteins had long been thought as be limited to bacteria and bacteria-descended eukaryotic organelles. However, recent study has found that Nt-formylated proteins are generated in the cytosol of Saccharomyces cerevisiae cells and they are up-regulated in stationary phase or upon starvation for specific amino acids. It has been also found that the S. cerevisiae formyltransferase Fmt1, which is mostly localized in mitochondrial matrix, pretranslationally formylates the N-termini of proteins synthesized from cytosolic ribosomes through the same mechanism with bacteria, mitochondria, and chloroplast. In addition, in stationary phase or upon starvation for specific amino acids, Gcn2 kinase phosphorylates Fmt1 and mediates it to be retained in the cytosol. It has been shown that the Nt-formylated proteins in the cytosol of S. cerevisiae were likely to be important for adaptation to various stresses and were selectively degraded by the fMet/N-degron pathway of ubiquitin-proteasome system through an Nt-fMet residue of protein as an N-terminal degradation signal (N-degron). However, it is still elusive which physiological changes are involved in cytosolic Nt-formylation of proteins and how these Nt-formylated proteins function for adaptation to stresses. Given that the cytosolic retention of Fmt1 precedes the Nt-formylation of protein in the eukaryotic cytosol, the reporter system to quantify the cytosolic level of Fmt1 might be one of the keys to understand the physiology related to Nt-formylated proteins and molecular mechanism underneath it. So, in this study, the fluorescent Fmt1 reporter was developed using split fluorescent proteins derived from superfold green fluorescent protein (sfGFP), and cytosolic Fmt1 levels were measured under various physiological conditions through split sfGFP complementation assay with high sensitivity. First, to validate my reporter system, Fmt1 C-terminally fused with sfGFP11 (Fmt1-sfGFP11) was co-expressed with cytosolic sfGFP(1-10) or mitochondrial sfGFP(1-10). The fluorescence measured by flow cytometry was greatly increased when both Fmt1-sfGFP11 and sfGFP(1-10) were retained in the same subcellular localization such as cytosol or mitochondria. Based on this, I verified that the cytosolic level of Fmt1 is significantly increased upon histidine starvation followed by up-regulation of Nt-formylated proteins as previously reported. I also found that tryptophan starvation could increase the cytosolic retention of Fmt1 and partially up-regulate the Nt-formylated proteins. Next, to address the physiological relevance of cytosolic Nt-formylation of proteins, cell viability upon histidine or tryptophan starvation was measured. It was shown that viable cells were greatly decreased upon histidine starvation more than upon tryptophan starvation. The viable S. cerevisiae cells were also decreased in the stationary phase similar to histidine-starved or tryptophan-starved cells. However, the cytosolic level of Fmt1 was greatly decreased in the stationary phase and Nt-formylated proteins were considerably up-regulated, indicating that the enzymatic activity of Fmt1 in the cytosol was increased as previously reported. Therefore, although decreases in cell viability might partly up-regulate cytosolic Nt-formylated proteins, it appears not to be strictly involved in cytosolic retention of Fmt1. To search for other physiological relevance of cytosolic Nt-formylated proteins, cell cycle was examined for S. cerevisiae cells upon histidine or tryptophan starvation. It was shown that 2n populations of cells were greatly reduced compared to non-starved cells when either starved for histidine or tryptophan. To determine whether DNA replication is relevant to cytosolic Nt-formylation of proteins, DNA-damaging agent, hydroxyurea (HU) or methylmethanesulfonate (MMS) was treated for S phase arrest, and then the cytosolic level of Fmt1 was measured. The cytosol-retained Fmt1 was increased in both HU and MMS-treated cells relatively more than that in non-treated cells, independently of Gcn2 kinase which mediates cytosolic retention of Fmt1 upon starvation for amino acids. Concomitantly, Nt-formylated proteins in the cytosol were up-regulated when HU or MMS was treated. Overall, subcellular localization of Fmt1, which precedes Nt-formylation of cytosol-synthesized proteins, could be regulated either by Gcn2 kinase upon starvation for amino acid or Gcn2-independent but not yet unidentified factors relevant to DNA replication. It might be suggested that the integrative combination of nutritional availability and replication capacity reflects the cellular status, which governs the cytosolic Nt-formylation of proteins, to be elucidated in detail.|박테리아와 진핵생물의 세포소기관인 미토콘드리아와 엽록체에서는 단백질 합성의 시작에 N-말단이 포밀화된 단백질인 포밀메티오닌(fMet)이 사용된다. 이는 일종의 합성 전 단백질의 화학적 변형 (pretranslational chemical modification)으로, tRNA에 결합된 메티오닌이 10- formyltetrahydrofolate (10-fTHF)를 기질로 사용하는 포밀트랜스퍼라제 (FMT)에 의해 N-말단이 포밀화되며 생성되는 fMet-tRNAi가 단백질 번역의 개시에 사용되며 일어난다. 이후 리보솜에 결합된 펩타이드 디포밀라아제 (peptide deformylase)에 의해 포밀기가 제거되는 것으로 알려져 있다. 그러나 최근, 진핵생물 Saccharomyces cerevisiae의 세포질에서 합성되어 미토콘드리아에서 기능하는 포밀트랜스퍼라제 Fmt1이 S. cerevisiae세포가 stationary phase에 들어가거나 특정 아미노산의 고갈과 같은 스트레스 상황이 도래했을 경우 Gcn2 kinase에 의해 인산화되면서 세포질에 잔류하며 fMet-tRNAi를 증가시키고 이로 인해 세포질 내에서 N-말단이 포밀화된 단백질이 합성될 수 있음이 밝혀졌다. 이렇게 생성된 단백질의 포밀메티오닌은 fMet/N-degron pathway의 N-degron으로 작용해 ubiquitin-proteasome system을 통한 N-말단 포밀화 단백질의 분해를 특이적으로 매개할 수 있으며, S. cerevisiae가 특정 스트레스 상황에 적응하고 생존함에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 하지만 세포질 단백질의 N-말단 포밀화에 중요한 Fmt1의 세포 내 위치와 다른 생리적 요인들과의 연관성에 대해서는 밝혀지지 않았으며, 다양한 요인들의 변화에 따른 Fmt1의 세포 내 위치 변화를 효과적으로 모니터링할 방법이 없어 이러한 연구를 더욱 어렵게 만들고 있다. 본 연구에서는 split GFP complementation assay를 도입하여 Fmt1의 세포 내 위치 변화를 높은 감도로 모니터링 하고자 하였다. 먼저 세포질 또는 미토콘드리아에 위치하는 sfGFP(1-10)을 발현하는 S. cerevisiae 세포 각각에 대해 Fmt1-sfGFP11을 발현하고 유세포 분석을 이용해 형광의 변화를 측정하여 Fmt1의 세포 내 위치를 확인할 수 있었다. 이를 기반으로 S. cerevisiae 세포질 단백질의 N-말단 포밀화를 증가시키는 것으로 보고된 히스티딘 고갈 조건에서 Fmt1의 위치변화를 확인하였으며, 기존의 보고와 다르게 트립토판 고갈 상황에서도 Fmt1의 위치변화를 확인할 수 있었으며, N-말단이 포밀화된 단백질이 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. 그리고 아미노산이 고갈될 때 cell viability의 차이가 발생하는 양상을 통해 Fmt1의 이동과 cell viability와의 연관성을 확인할 수 있었다. 또한, S. cerevisiae 세포에서 세포질 단백질의 N-말단 포밀화가 증가한다고 알려진 stationary phase에 진입으로 인해 나타나는 Fmt1의 위치변화를 확인하기 위해, 배양시간에 따른 Fmt1의 위치와 N-말단 포밀화된 리포터 단백질의 양을 분석하였고, 그 결과 stationary phase에서 N-말단이 포밀화된 단백질의 생성이 Fmt1의 위치변화와 효소 활성 조절에 연관된 양상을 확인할 수 있었으며, 아미노산 고갈 조건과는 달리 cell viability와 연관성이 크지 않은 양상을 확인할 수 있었다. 따라서 히스티딘 고갈이나 트립토판 고갈 조건에서의 S. cerevisiae 세포들이 cell viability를 제외한 또다른 생리적 차이를 보이는지 확인하기 위해 각각의 조건에서 세포 주기 분석을 진행하였고, 각각의 아미노산이 고갈된 조건에서 S. cerevisiae세포들이 공통적으로 2n 상태로 온전하게 들어가지 못함을 확인할 수 있었다. 이와 같은 양상이 DNA 복제에 문제로인하여 발생하며 그 결과로 N-말단이 포밀화된 단백질이 증가하는 양상을 띄는지 확인하기 위해 DNA 손상을 유발하는 hydroxyurea (HU)와 methylmethanesulfonate (MMS)를 처리한 S. cerevisiae 세포에서 Fmt1의 위치를 분석하였으며, HU와 MMS를 처리한 S. cerevisiae 세포들 모두에서 Fmt1의 위치변화가 유의미하게 증가하며 세포질 단백질의 N-말단 포밀화도 증가하는 것으로 확인하였다. 또한, DNA가 손상된 S. cerevisiae세포에서 증가한 Fmt1의 위치변화는 기존에 보고된 Gcn2 kinase에 의해 조절되지 않는 것을 확인하였다. 따라서Fmt1의 세포 내 위치변화는 stationary phase의 진입이나 특정 아미노산의 고갈을 감지하는 Gcn2 kinase에 의한 기전과 DNA 손상에 따른 DNA 복제 과정 상 발생하는 스트레스를 감지하는 Gcn2 kinase에 독립적인 기전이 복합적으로 작용하며 조절되는 것으로 사료된다.