Development of novel amphiphiles with high hydrophobic density for membrane protein study

Abstract

막 단백질은 cell-cell recognition, signal transduction, material transport, cell movement 과 같은 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 한다. 막 단백질 구조는 합리적인 약물 설계와 개발 과정의 필수적인 부분이다. 막 단백질의 구조와 기능에 대한 이해의 중요성에도 불구하고, 실험적으로 결정된 구조를 가진 이러한 bio-macromolecules (membrane proteins)의 수는 가용성 단백질에 비해 현저히 낮다. 이는 주로 막 단백질의 고유한 양친매성 구조 때문에, 정제 및 구조 연구 중에 응집되거나 변성될 가능성이 훨씬 높다. Membrane-mimetic environments 은 막 단백질 구조를 downstream characterizations 에 적합한 상태로 보존하기 위해 필요하다. 작은 양친매성 분자에 의해 형성된 micellar system 은 수용성 환경으로부터 막 단백질의 큰 소수성 부분을 보호하는 세포막을 위한 효과적인 방벽(surrogate)이다.Detergent 는 막 단백질 가용화(solubilization), 정제(purification) 및 구조 분석(structural analysis)에 널리 사용된다. 지난 20 년 동안 향상된 특성을 가진 새로운 detergent를 설계하기 위해 많은 노력을 기울여 왔다. 본 논문의 첫 번째 장으로서, 우리는 특히 광범위한 막 단백질 구조의 성공적인 결정에 널리 적용된 OGNG, LMNG 및 GDN 에 초점을 맞추고 있다. 이 논문은 지난 10 년간 막 단백질 구조 연구를 위한 OGNG, LMNG 및 GDN 의 실제 적용에 대해 논의한다. 이 논문은 또한 detergent-detergent 및 detergent-protein 상호 작용(interactions) 측면에서 protein-detergent complexes (PDCs)의 안정성을 분석함으로써 이들 detergents 의 고유한 행동의 생물물리학적(biophysical) 기초에 대한 통찰력을 제공한다. 두 번째 장에서, OGNG 의 새로운 변종(variants)으로, 우리는 각각 세 개의 glucoside units 과 두 개의 알킬 사슬을 머리와 꼬리 그룹으로 포함하는 1,3- acetonedicarboxylate-derived amphiphiles (ACAs)를 개발했다. ACAs 는 두 가지 다른 패턴의 알킬 사슬 부착을 detergent core unit 에 도입함으로써 ACA-As (asymmetrically alkylated)와 ACA-Ss (symmetrically alkylated)의 두 가지 양친매 세트를 생성한다. detergent 알킬 사슬의 부착 패턴 차이는 미셀 크기 (micelle size), 임계 미셀 농도 (CMC), 막단백질 추출 (extraction) 및 안정화 (stabilization)를 향한 detergent behavior 등 detergent properties 에 미세한 변화를 가져왔다. 대조적으로, detergent 알킬 사슬 길이가 단백질 안정성에 미치는 영향은 두드러졌다. 두 가지 C11 varianst (ACA-AC11 및 ACA-SC11)는 실험된 단백질을 안정화시키는 데 가장 효과적이었다. 3 개의 glucoside 의 존재 덕분에, ACA 는 OGNG 보다 상대적으로 긴 알킬 사슬에 도달할 수 있다. 미래 연구 방향성을 위해서 막 단백질 연구를 위한 새로운 calix[4]arene based maltoside amphiphiles (CXMs)를 소개한다. 몇몇 calix[4]arene based detergent 는 이미 보고되었으며, 우리는 detergent-protein 및 detergent-detergent 상호 작용 측면에서 시판되고 있는 여러 calix[4]arene based detergent 의 특성에 대해 논의한다. detergent 의 설계 원리에 기초하여, 우리는 4 개의 maltoside 와 4 개의 알킬 사슬을 도입하는 calix[4]arene based detergent 를 개혁(reform)한다. Calix[4]arene 의 rigidity 및 높은 소수성 내부(hydrophobic interior)는 막 단백질 안정화에 긍정적인 효과를 제공할 수 있다. 마지막으로 막 단백질 연구를 위해 두 종류의 새로운 detergents (ACAs 와 CXMs)가 도입되었다. PDC 에서 높은 소수성 밀도를 유도하는 인기 있는 detergent (예: OGNG, LMNG)의 추가적인 개선을 위해 다소 간단한 접근법이 적용되었다. 현재 연구는 막 단백질 연구의 도구로 새로운 glucoside/maltoside 를 소개할 뿐만 아니라, 새로운 양친매체의 향후 설계에 중요한 detergent structure-property relationships 를 제공한다|Membrane proteins play crucial roles in a variety of cellular functions such as cell-cell recognition, signal transduction, material transport, and cell movement. membrane protein structures are an essential part of the rational drug design and development process. Despite the importance of understanding structure and function of membrane proteins, the number of these bio-macromolecules with experimentally determined structure is significantly lower than that of soluble proteins. This is due mainly to the inherent amphiphilic architecture of membrane proteins, making them much more likely to aggregate or denature during purification and structural studies. Membrane-mimetic environments are necessary to preserve membrane protein structures in a state suitable for downstream characterizations. Micellar system formed by small amphiphilic molecules are an effective surrogate for the cell membrane that shields the large hydrophobic portions of membrane proteins from the aqueous environment. Detergents are widely used for membrane protein solubilization, purification and structural analysis. Over the past two decades much effort has been made to design novel detergents with improved properties. Here as a first chapter of this thesis, we particular focus on OGNG, LMNG and GDN, which have been widely applied to the successful determination of a wide range of membrane protein structures. The thesis discusses practical application of OGNG, LMNG and GDN for membrane protein structural studies over the last decade. This thesis also provides insights into the biophysical basis of the distinct behaviors of these three detergents by analysis of the stability of protein-detergent complexes (PDCs) in terms of detergent-detergent and detergent-protein interactions. In second chapter, as new variants of OGNG, we developed 1,3-acetonedicarboxylate-derived amphiphiles (ACAs) containing three glucose units and two alkyl chains as head and tail groups, respectively. The ACAs incorporate two different patterns of alkyl chain attachment to the core detergent unit, generating two sets of amphiphiles: ACA-As (asymmetrically alkylated) and ACA-Ss (symmetrically alkylated). The difference in the attachment pattern of the detergent alkyl chains resulted in minor variation in detergent properties such as micelle size, critical micelle concentration, and detergent behaviors toward membrane protein extraction and stabilization. In contrast, the impact of the detergent alkyl chain length on protein stability was marked. The two C11 variants (ACA-AC11 and ACA-SC11) were most effective at stabilizing the tested membrane proteins. Thank to presence of three glucosides head groups, ACAs can reach to relatively elongated alkyl chains than those of OGNG. Elongated alkyl chains contribute to improved membrane protein stabilizing efficacy due to enhanced hydrophobic density and dimension as well with the hydrophobic region of membrane protein. For future direction, we introduce a new class of calix[4]arene-based maltoside amphiphiles (CXMs) for membrane protein study. Several calix[4]arene-based detergents were already reported and we discuss the properties of several commercially available calix[4]arene-based detergents in terms of detergent-protein and detergent-detergent interaction. Based on the design principle of detergents, we reform the calix[4]arene-based detergents introducing four maltosides and four alkyl chains. Calixarene unit is highly versatile providing two variants: 4CXMs (bearing four alkyl chains with the same number of carbons) and 2,2CXMs (bearing two of short chains and long chains, respectively). Rigid and highly hydrophobic interior of calix[4]arene may provide positive effect to membrane protein stabilization. Finally, two classes of novel detergents (ACAs and CXMs) were introduced for membrane protein study. Somewhat simple approach has been adapted for further improvement of popular detergent (e.g., OGNG, LMNG) inducing high hydrophobic density in the PDCs. The current study not only introduces new glucosides/maltosides as tools for membrane protein study, but also provides detergent structure-property relationships important for future design of novel amphiphiles.