CRISPR/Cas9-based screening of deubiquitinases as a pharmacological target for sensitizing drug-resistant tumors

Abstract

Deubiquitinating enzymes (DUBs) are a family of proteases that remove ubiquitin from proteins undergoing degradation. DUBs play several functional roles other than deubiquitination that is involved in cellular functions, such as cell signaling, DNA repair, cell-cycle regulation, and stem cell differentiation. It can be used as an excellent model for exploring DUB functions through a loss-of-function study based on the DUB gene defect model in mammalian cells. In this study, I used CRISPR-Cas9 to perform genome-scale knockout of the entire set of genes encoding DUBs and then systematically screened for DUBs that are involved in conferring drug resistance mechanism. To provide the proof-of-concept that DUBs regulates cancer drug resistance, I applied our loss-of-function based DUBKO sgRNA libraray kit to screen potential DUBs that are involved in resistance to cisplatin, a highly versatile anticancer drug. Cisplatin is the first and most frequently used platinum-based drug, making it the frontline anticancer agent for treating a broad spectrum of cancers. However, development of cisplatin-resistance limits the therapeutic efficacy of cisplatin-based treatment. Kinome-wide screening for the genes responsible for cisplatin-resistance in cancers identified microtubule-associated serine/threonine kinase 1 (MAST1) as a main driver of cisplatin-resistance by rewiring the MEK pathway. However, the molecular mechanism regulating MAST1 protein abundance through the ubiquitin proteasomal system in cisplatin-resistant cancers is unknown. In this study, I identified E3 ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs) regulating MAST1 protein turnover specifically in cisplatin resistant cancers. I implemented CRISPR-Cas9-based dual screening approach to perform genome-scale knockout of an entire set of DUB genes and screen for DUBs conferring cisplatin resistance and regulating MAST1 protein abundance. I identified USP1, a deubiquitinating enzyme as a protein stabilizer of MAST1-mediated cisplatin-resistance in human cancers. Additionally, I also screened for several E3 ligases for MAST1 and identified Cdh1 promoting MAST1 protein degradation to overcome MAST1-driven cisplatin-resistance in cancers. I further demonstrated that USP1 stabilizes, interacts and extends the half-life of MAST1 by preventing its Cdh1-mediated protein degradation. USP1 promotes MAST1-mediated MEK1 activation as an underlying mechanism that contributes to cisplatin-resistance in cancers. Targeted genome knockout of USP1 results in significant enrichment of apoptotic factors BIM and cleaved PARP and further reduces the growth of cisplatin-treated tumor xenografts in NSG mice. Additionally, the combined pharmacological inhibition of USP1 and MAST1 using small molecule inhibitors further abrogated MAST1 levels and synergistically enhanced cisplatin efficacy in mouse xenograft model. I also reported USP19, a nuclear-localized DUB, stabilizing endogenous expression of survivin protein in cancer cells. I anticipate that simultaneous targeting of USP19 and survivin would increase its therapeutic values and minimize redundancy of oncology-associated drug development. Taken together, I believe my approach for the identification of DUBs regulating cancer drug resistance will benefit in understanding various target proteins associated with cancer-related pathways to overcome drug resistance and improve clinical care. |탈유비퀴틴 효소(Deubiquitinating enzyme, DUB)는 분해 중인 단백질에서 유비퀴틴을 제거하는 단백질 분해 효소이다. DUB는 세포 신호 전달, DNA 복구, 세포 주기 조절, 줄기세포 분화 등과 같은 세포 기능에 관여하는 유비퀴틴 제거외에도 여러 가지 기능을 수행한다. 포유류 세포의 DUB 유전자 결함 모델을 기반으로 한 기능 상실 연구를 통해 DUB 기능을 탐색하는 모델이 활용되고 있다. 본 연구에서는, CRISPR-Cas9을 사용하여 DUB를 인코딩하는 전체 유전자 세트의 게놈 스케일 녹아웃을 수행한 다음, 약물 저항 메커니즘을 부여하는 데 관여하는 DUB를 체계적으로 선별을 진행하였다. DUBs가 암 약제 내성을 조절한다는 개념을 증명하기 위하여, 기능상실 기반 DUB-KO sgRNA 라이브러리 키트를 적용하여, 다용도 항암제인 시스플라틴에 대한 내성과 관련된 잠재적 DUB를 선별하였다. 시스플라틴은 백금을 기반으로 한 빈번하게 사용되는 약으로, 광범위한 암을 치료하는데 쓰이는 항암제이다. 하지만 시스플라틴 내성의 발생으로 인해 시스플라틴 기반 치료의 치료 효과가 제한된다. 암에서 시스플라틴 내성을 담당하는 유전자에 대한 키놈 전체 스크리닝을 통해 MEK 경로를 분석하여 시스플라틴 내성의 주요 인자로 마이크로튜블 관련 세린/트레오닌 키네이스 1 (MAST1)이 보고되었다. 그렇지만 시스플라틴 내성 암에서 유비퀴틴 프로테아솜 시스템을 통해 MAST1 단백질의 변화를 조절하는 분자 메커니즘은 아직까지 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 시스플라틴 내성암에서 MAST1 단백질의 전환을 조절하는 E3 연결효소와 DUB를 발굴하였다. 본 연구에서는 CRISPR-Cas9 기반 이중 스크리닝 접근법을 구현하여 전체 DUB 유전자 세트의 게놈 스케일 녹아웃과, 시스플라틴 내성과 MAST1 단백질의 변화를 조절하는 DUB에 대한 스크리닝을 수행하였다. 실험 결과 인간 암에서 MAST1 매개 시스플라틴 내성 단백질 안정화제로서 탈유비퀴틴 효소인 USP1을 확인하였으며, MAST1에 대한 몇 가지 E3 리게이스에 대해 스크리닝을 통해 암에서 MAST1에 의해 유도되는 시스플라틴 내성을 극복하기 위해 MAST1 단백질 분해를 촉진하는 Cdh1을 식별하였다. 또한 USP1은 MAST1의 Cdh1 매개 단백질 분해를 방지하여 MAST1의 반감기를 안정화, 상호작용 및 연장한다는 것을 입증하였다. USP1은 암에서 시스플라틴 내성에 기여하는 기본 메커니즘으로 MAST1 매개 MEK1 활성화를 촉진한다. USP1의 표적 게놈 녹아웃은 아포토시스 인자 BIM과 절단된 PARP를 상당히 증가시키며, NSG 생쥐에서 시스플라틴 처리된 종양 이종 이식물의 성장을 더욱 감소시켰다. 또한, 억제제를 사용한 USP1과 MAST1의 결합의 약리학적 억제는 MAST1 수준을 더욱 저하시키며 마우스 이종 이식 모델에서 시스플라틴 효과를 상승적으로 향상시켰다. 또한 핵에 존재하는 DUB인 USP19가 암세포에서 생존단백질의 내인성 발현을 안정화시킨다는 결과도 보고하였다. 이러한 결과는 USP19와 서바이벌의 동시 타겟팅이 치료적 가치를 높이고 종양학 관련 약물 개발의 중복을 최소화할 것으로 예상한다.