인체 유래 담즙 시료의 적외선/근적외선 분광법 및 질량 분석법 측정을 통한 신속한 담낭암 판별법 개발

Abstract

This thesis is composed of three researches performed to develop analytical tools for screening of gallbladder (GB) cancer using bile as a specimen separately using infrared (IR), near-infrared (NIR), and paper-spray-ionization mass (PSI-MS) analysis. In the Chapter Ⅰ, the discrimination of GB cancer against normal, GB polyp, and hepatocellular carcinoma (HCC) was attempted using IR analysis of human bile. Raw bile juice was viscous and complex in composition; therefore, acquisition of IR spectra providing more component-discernible information was fundamental for improving discrimination. Therefore, the separation of raw bile juice into three sections of organic, aqueous, and amphiphilic phases was performed and IR spectra of each separated phase were collected. Simultaneously, concentrations of three bile acids and eight bile salts in the aqueous phase samples were determined in parallel and lipidomic analysis of nine lipid classes in the organic phase samples was performed using LC-MS. Lipids such as phosphatidylcholines and phosphatidylethanolamines were more disease-descriptive bile components than bile salts because their levels were markedly lower and their relative abundances in the organic phase of GB cancer samples were different from those of other samples. Therefore, the principal component (PC) scores of organic phase spectra were able to discriminate GB cancer clearly from the other groups. Dilution of bile constituents due to degraded water absorption ability of GB and variation in the relative abundances of individual lipid species due to altered metabolic pathways by GB cancer likely enabled the bile-based IR spectroscopic identification of GB cancer. NIR spectroscopy, able to directly measure raw bile without the three-phase extraction, was evaluated for the same purpose in the Chapter II. NIR spectra of the raw bile samples dried on a non-NIR absorbing polytetrafluoroethylene (PTFE) was simply obtained by a whole-sample-covering transmission NIR scheme. Since the bile salt and lipid composition in the bile samples of GB cancer were different, the corresponding NIR spectral features such as ratios of peak intensities were somewhat different from those of normal, gallstone, GB polyp, HCC samples. Nonetheless, the discrimination of GB cancer group in the PC score domain was rather moderate with the accuracy of 87.8%. Meanwhile, when two-trace two-dimensional (2T2D) correlation analysis of a sample spectrum was performed using a reference spectrum constructed by linear combination of the spectra of 5 main representative metabolites in bile, the asynchronous correlation maps of normal, gallstone, GB polyp, and HCC were quite similar with each other, but apparently dissimilar to that of GB cancer. With using the PC scores of 2T2D slice spectra, the accuracy of GB cancer discrimination improved to 94.3% owing to the sensitive catch of dissimilarly characteristic spectral features of GB cancer. In the Chapter Ⅲ, PSI-MS analysis of bile was demonstrated as a tool for acquisition of detail molecular compositional information of bile with simplicity. One uL of diluted bile was dropped on a filter paper tip (triangular shape) and 10 uL of spraying solvent was added with high voltage application for spectral acquisition. MS spectra of the bile samples contained strong peaks from various components such as bile salts and phospholipids. Four high peak intensities of bile salts and peak ratio of six major phospholipids were used as the input variables for the GB cancer discrimination. Next, the statistical significance in the difference of the selected variables between 2 groups was evaluated. The bile salts peak intensities of GB cancer samples were quite lower than those of remained groups (p-value less than 0.05). The peak intensities of phosphatidylcholine among the samples largely varied; while, the intensity ratios of major phosphatidylcholine peaks were discriminant GB cancer with p-value less than 0.05. In overall, PSI-MS was a promising tool for the molecule-based screening of GB cancer. |본 학위 논문에서는 담낭 내 저장되는 담즙을 다양한 분광기를 이용해 스펙트럼의 차이를 관찰함으로써 여러 질병 중 담낭암 시료의 판별 정확도를 향상시키는 연구를 기술하였다. 본 연구는 총 3장으로 구성되어 있다. 제1장에서는 적외선 분광기와 LC-MS를 이용한 담즙의 성분 분석 및 담낭암 판별 연구에 대해 서술하였다. 제2장에서는 보다 신속해진 스펙트럼 획득을 위한 근적외선 분광법 스킴을 기술하였으며 담낭암의 판별 정확도를 향상시키기 위한 이차원 상관분석법 적용을 제안하였다. 제3장에서는 종이분무이온화 질량분석법을 도입하여 신속하게 담즙의 성분 정보를 획득하고 이를 이용해 담낭암을 판별하는 방법을 제시하였다. 각 장 별로 스펙트럼을 이용해 정상군, 담석, 용종, 간암 시료군들로부터 담낭암 시료군을 판별하였다. 제1장의 내용은 크게 담즙의 적외선 분광기 측정을 통한 정성 분석과 이를 뒷받침하기 위한 실제 담즙의 LC-MS 분석 및 두 결과의 통계학적 분석에 관한 내용으로 구성되어 있다. 성분이 복잡하고 고농도인 담즙의 효율적인 적외선 스펙트럼 획득을 위해 유기 용매를 이용한 층 분리 추출법을 제안하였으며 그 결과 얻어진 유기용매층, 수용액층과 단백질 침전층의 스펙트럼을 각 질병군 별로 수집하였다. 각 층의 적외선 스펙트럼을 통해 담즙에 포함된 주된 성분들을 추측하였고 그 함량이 각기 다름을 확인하였다. 적외선 스펙트럼 관측 결과 담낭암 군에서 상당히 다른 스펙트럼 개형이 나타났으며 주성분 분석 시에도 다른 시료군과 다른 분포를 나타냄을 확인하였다. 적외선 분석 결과가 실제 시료의 특성을 잘 반영하였는지 확인하기 위해 LC-MS를 이용하여 담즙산과 지방질의 종류와 농도를 측정하였다. 각 층의 데이터를 이용한 판별 정확도 계산 결과, 지방질 데이터를 이용하였을 때 제일 높은 수치가 나타나 담낭암 환자에게서 담즙 내 지방 성분 및 농도에 변화가 나타남을 확인하였다. 적외선 분광법 및 LC-MS의 경우 시료의 전처리에 상당한 시간이 소요되기 때문에 이를 극복하기 위한 방안 중 하나로 근적외선 분광법을 도입하였으며 해당 연구 내용을 제2장에 기술하였다. 짧은 파장 길이로 인해 투과도가 높은 광원의 특성을 이용하여 간단하게 기판에 떨어뜨려 용매를 증발시킨 담즙의 전 영역에 광원을 조사하여 스펙트럼을 획득하였다. 전체 스펙트럼을 비교하였을 때 담낭암의 스펙트럼에서 C-C 결합과 아마이드 결합의 흡광도 세기에서 차이가 발견되었으며 두 스펙트럼 세기의 비율 값에 Mann-Whitney U 검정법을 적용하여 통계적 신뢰도를 확인한 결과 신뢰도 높은 담낭암 판별이 가능하였다. 주성분 분석 시의 판별 정확도를 계산한 결과 약 88%의 정확도가 나타났기 때문에 이를 향상시키고자 이차원 상관 분석법을 도입하였다. 담즙 내 순물질들의 NIR 스펙트럼을 선형 근사를 통해 질병 별 평균 스펙트럼과 유사한reference 스펙트럼을 획득하였다. 이와 실제 스펙트럼을 이용한 상관분석 시 담낭암의 경우가 correlation map 및 slice spectrum에서 큰 차이가 나타났고 위 데이터를 이용한 판별 정확도 계산 시 94%로 향상된 결과를 얻을 수 있었다. 시료를 건조한 뒤 근적외선 스펙트럼을 획득할 경우 실제 성분의 농도 관련 정보는 제거되기 때문에 이를 극복하고 간단히 담즙 내 지방 농도를 측정하기 위한 방식으로 담즙 유기 추출물을 건조하지 않고 직접 근적외선 분광기로 측정하는 방법이 제안되었다. 적은 수의 시료만 측정되었지만, 담낭암의 경우 상당히 약한 지방의 메틸기 흡광 스펙트럼이 관측되어 담즙 유기층의 측정을 통한 지방질 정량 분석의 가능성을 시사하였다. 측정 시간을 단축하기 위한 또 하나의 방법으로 종이분무이온화 질량 분석법을 담즙 측정에 도입하였고 이를 제3장에 기술하였다. 작은 삼각형 모양으로 자른 거름종이에 희석한 담즙을 떨어뜨린 뒤 전압을 가해준 상태에서 용매를 소량 가해 간단하게 질량 분석 스펙트럼을 획득하였다. 1장에서 서술한 LC-MS와 유사하게 담즙산 및 지방질의 스펙트럼이 강하게 나타나 종이분무이온화 질량분석법을 이용한 담낭 질병 판별의 가능성을 관측하였다. 순물질 또한 측정하여 담즙에서 얻어진 피크가 실제 담즙 내 포함되어 있음을 확인하였고, 개중 농도가 높은 담즙산과 phosphatidylcholine 들의 피크 intensity 값을 이용하여 담낭암을 판별하고자 하였다. 획득한 담즙산과 지방질의 피크의 세기 및 여러 지방질 간 비율을 질병군 별로 분석한 결과 담낭암군과 다른 시료군에서 나타나는 세기의 차이가 통계적으로 신뢰할 수 있음을 확인하였다.