Antimicrobial and Anti-biofilm Activities of Weissella cibaria

Abstract

The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial and anti-biofilm activity of Weissella cibaria CMU (oraCMU) and CMS1(oraCMS1) against peri-implantitis and upper respiratory infection pathogens (URTIs). The chapter 1 used the periodontal-causing pathogens Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis to investigate the potential of W. cibaira to prevent peri-implantitis. As a result of confirming the antimicrobial activity of the cell-free supernatant (CFS) against periodontal pathogens, after culturing for more than 16 h, CFS was inhibited by about 100%, and the antimicrobial activity was significantly reduced after neutralization. A similar trend was observed in the anti-biofilm effect, but the biofilm of P. gingivalis also inhibited CFS after neutralization. For biofilm assay periodontal pathogens on the dental implant were grown with live or CFS in 24-well plates in presence of abutment or fixture. Biofilms were stained with 0.1% crystal violet or analyzed by phase-contrast microscope. Significant inhibition in the biofilm of P. gingivalis or P. gingivalis with F. nucleatum were observed in presence of both live and CFS of oral probiotics. These results indicate that W. cibaria probiotics may have promising applications in preventing dental implant biofilm. Chapter 2 used Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, S. pneumoniae, and Moraxella catarrhalis, which are major pathogens of URTIs, to confirm the potential of W. cibaira to prevent URTIs. The antimicrobial activities of W. cibaria were compared with those of other oral probiotics using a competitive inhibition assay and the determination of the minimum inhibitory concentrations (MICs). In addition, a time-kill assay, spectrophotometry, and confocal laser scanning microscopy were used to confirm the antimicrobial and anti-biofilm abilities of oraCMU and oraCMS1. Both live cells and CFSs of all tested probiotics, except S. salivarius, showed excellent antimicrobial activities. All target pathogens were killed within 4 to 24 h at twice the MIC of oraCMU and oraCMS1, which showed the highest antimicrobial activities against M. catarrhalis. The antimicrobial substances that affected different target pathogens were different. Both oraCMU and oraCMS1 showed excellent abilities to inhibit biofilm formation and remove preformed biofilms. Our results suggest that the W. cibaria probiotics offer new possibilities for the prevention and treatment of bacterial URTIs.|Weissella cibaria CMU 와 CMS1 이 임플란트 주위염과 상부호흡기 감염 병원균에 대한 항균 및 항바이오필름 활성을 평가하였다. W. cibaira 이 임플란트 주위염 예방 가능성을 조사하기 위해 치주유발 병원균이 Fusobacterium nucleatum 과 Porphyromonas gingivalis 을 이용하였다. W. cibaira의 상청액은 F. nucleatum과 16시간 배양 후부터 100%의 항균활성을 나타냈으며, 중화 후 상청액은 오히려 16 시간 배양 후 대한 F. nucleatum 에 대한 항균활성을 거의 잃었다. 이와 비슷하게 P. gingivalis 에 대해서도 W. cibaria 의 상청액은 16 시간 후부터 거의 100%의 항균 활성을 나타냈으며, 중화 후 상청액은 16 시간 후부터 20%로 안되는 항균력은 보였다. 또한, W. cibaria 의 상청액은 F. nucleatum 의 바이오필름 형성을 항균활성에서 보였듯이 16 시간 배양 후부터 100% 가까운 억제를 하였으며, 상청액의 중화 후에는 바이오필름 형성을 전혀 억제하지 못하였다. 하지만 W. cibaria 상청액과 P. gingivalis 이 16 시간 배양 후부터 바이오필름 형성을 W. cibaria 상청액이 100% 가까이 억제하였고, 중화 후 상청액도 바이오필름 형성 억제 활성이 감소하였지만 80%에 가까운 활성을 보였다. 또한, 임플란트에 실제로 적용하여 바이오필름 형성억제를 평가하였다. 임플란트 상부구조물과 고정체에 각각 F. nucleatum 와 P. gingivalis 을 동시에 배양할 때 W. cibaria 의 생균과 상청액을 처리해보았다. 임플란트를 적용하지 않았을 때와 유사한 결과를 보였으며, 상부구조물에서 바이오필름 형성 억제가 더 우수하였다. 위상차 현미경으로 확인한 결과, W. cibaria 을 처리한 군에서 F. nucleatum 와 P. gingivalis 의 양이 현저히 줄을 것을 확인하였다. W. cibaira 가 상부호흡기 감염 예방 가능성을 확인하기 위해 상부호흡기 감염(URTIs) 주요 병원균인 Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, S. pneumoniae, Moraxella catarrhalis 을 이용하였다. 상용화 구강프로바이오틱스 5 종 (W. cibaria CMU 와 CMS1, S. salivarius, Limosilactobacillus reuteri, Ligilactobacillus salivarius)의 생균과 상청액으로 URTIs 주요 병원균 4 종에 대해 항균활성을 competitive Inhibitio 와 minimum inhibitory concentrations (MICs)로 비교 평가한 결과, S. salivarius 을 제외하고 모두 유사한 항균활성을 보였다. W. cibaria CMU 와 CMS1 의 상청액 2 X MIC, 1 X MIC, 1/2 X MIC 로 time kill assay 를 한 결과, S. pyogenes, Staph. aureus, S. pneumoniae, M. catarrhalis 에 대해 각각 2 X MIC 에서 6, 24, 24, 4 시간만에 사멸시켰다. W. cibaria 의 상청액이 URTIs 주요 병원균에 영향을 미친 항균물질은 S. pyogenes 에는 유기산과 H2O2, Staph. aureus 와 S. pneumoniae 에는 유기산, M. catarrhalis 에는 유기산과 H2O2, 박테리오신유사물질이었다. W. cibaria 의 생균 (in Transwell insert)은 S. pyogenes, S. aureus, S. pneumonia, M. catarrhalis 의 바이오필름 형성을 각각 60–62%, 68–76%, 56–62%, 54–59% 억제하였고 상청액은 각각 80–86%, 92–93%, 73–74%, 56–61% 억제하였다. 또한, W. cibaria 의 생균 (in Transwell insert)이 각각 16%, 35-45%, 0%, 20-33%을 상청액은 30%, 63- 67%, 38-40%, 57-62% 바이오필름을 제거하였다. 결과적으로 W. cibaria 는 임플란트 주위염과 URTIs 관리에 대체 예방으로서의 가능성을 확인하였다.