Microalgal strain improvement for enhanced lipid and carotenoid production

Abstract

미세조류의 바이오매스는 3세대 바이오디젤 생산을 위한 원료뿐만 아니라 식품, 사료, 의약품, 기능식품 등의 지속 가능한 공급원으로 높은 잠재력을 가지고 있다. 미세조류의 모델 종인 Chlamydomonas reinhardtii는 입증된 형질전환 방법을 통해 다른 미세조류보다 쉽게 돌연변이체를 얻을 수 있는 장점으로 미세조류의 다양한 대사에 대한 이해를 제공하고 있고, 제공된 대사 기작은 미세조류의 산업적 응용 가능성을 높이는데 기여하고 있다. Ettlia sp. YC001 (이하 Ettlia sp.)는 대한민국 대전에서 분리된 미세조류로서, 5-10% 이산화탄소 농도에서 40% 이상의 총 지질 함량을 축적할 수 있을 뿐만 아니라, carotenoid 함량이 높다. 본 연구는 C. reinhardtii의 지질 합성 대사를 조절하여 TAG의 축적을 증대시키고, Ettlia sp. 의 종특이적 형질전환 방법 최적화와 식물 유래 단백질의 이종 발현을 통해 carotenoid 축적을 유도하였다. 식물과 미세조류의 지질 재편은 막 지질의 안정성을 유지하고 TAG를 축적시키는 스트레스 대응 기작이며, 미세조류에서 중성 지질을 증대시키는 전략 중의 하나이다. C. reinhardtii의 엽록체 막 지질 중 가장 많은 양을 가진 MGDG는 엽록체의 구조을 유지시킬뿐만 아니라 광합성 시스템 유지에도 기여한다. MGDG를 합성하는 MGD1을 ami-RNA로 발현을 저해함으로써, 비생물학적 스트레스와 유사한 환경을 조성하여 TAG의 축적을 유도하고자 하였다. MGD1이 하향 조절된 돌연변이는 MGDG의 합성 저해뿐만 아니라 이로 인하여 ER stress와 ROS가 증가하는 현상을 보였으며, 이로 인해 중성지질 생합성 유전자들의 발현이 증가됨을 확인하였다. 최종적으로 증가된 유전자들의 발현으로 중성 지질이 야생형에 비해 8배이상 축적되었으며, 고광과 질소결핍 조건에서 TAG 생산성은 21 mg/L/d까지 증가된 것을 보였다. 게다가, 돌연변이체의 지방산 조성은 스트레스 조건에서 바이오디젤 품질이 적합하게 향상되는 것을 보였다. 이를 통해, 막 지질 합성 유전자 조절은 중성 지질의 증대뿐만 아니라 지방산 조성의 변화를 통해 바이오디젤 생산에도 적합한 전략 중 하나가 될 수 있을 것이라 제안한다. Ettlia sp. 는 지난 10년간 배양 최적화, 물질 축적, 수확 등 다양한 분야의 연구를 통해 산업적 이용의 잠재력을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 하지만 Ettlia sp. 가 축적할 수 있는 지질 및 carotenoid 함량은 한계가 있었으며, 이로 인하여 유전공학적 접근을 통해 이 한계를 극복하고자 하였다. Ettlia sp. 의 종 특이적 형질전환 방법을 개발하기 위해, 우리는 외래 유전자 전달 방법으로 electroporation의 최적화를 수행하였다. 5 kV/cm의 조건에서 형질전환 효율이 향상되는 것을 확인하였으며, 다음으로 외래 유전자의 안정적인 발현을 도모하기 위해 내인성 promoter를 개발하였다. 내인성 promoter는 전사체 분석을 통해 세포 성장 주기에 따라 높게 발현되는 유전자로 선택하였으며, CRT와 psaD가 내인성 promoter로 적합성을 보였다. 최적화된 electroporation과 내인성 promoter를 이용하여 형광 단백질 (CFP)의 발현을 유도하였으며, 그 결과, CFP의 발현이 두 내인성 promoter를 사용한 돌연변이체에서 안정적으로 발현되는 것을 확인하였으며, 생성된 돌연변이체는 20개월 이상 변화된 형질을 유지하는 것으로 확인되었다. 앞선 연구에서 최적화된 형질전환 방법을 이용하여 Ettlia sp. 에 고구마 유래 orange protein (IbOr)을 이종발현시켰다. 고구마의 orange protein은 식물에서 carotenoid 함량을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, 특히 β-carotene의 축적을 유도한다. IbOr의 이종발현을 통해 β-carotene과 ketocarotenoid 함량을 증가시키는 것이 이 연구의 목적이었으며, IbOr이 도입된 Ettlia sp. 돌연변이체는 질소 결핍과 고광의 이중 스트레스 조건에서 야생형보다 높은 carotenoid 축적을 보였다. 특히, β-carotene과 astaxanthin 생산성이 각각 4.74 mg/L/d와 2.78 mg/L/d까지 증가되었다. 이 연구는 ketocarotenoid를 생산하는 미세조류중에서 처음으로 시도된 orange protein의 이종 발현 연구이며, Ettlia sp.의 종 특이적 형질전환 방법의 재현성을 입증하였다. 이 연구는 미세조류 개량을 통해 TAG 및 carotenoid 생산성을 높이는 것이며, 생합성 유전자의 하향 조절과 과발현을 통해 C. reinhardtii와 Ettlia sp. 에서 TAG와 carotenoid 생산성을 증대시킬 수 있었다. 따라서 본 연구에서 제시된 전략은 산업적으로 이용되고 있는 미세조류주에 적용된다면 높은 생산성을 달성할 것으로 기대된다. |Microalgal biomass has high potential as a sustainable source for food, feed, pharmaceuticals, and nutraceuticals as well as 3rd generation biodiesel feedstock. Research on Chlamydomonas reinhardtii, a model species in microalgae for which mutants can be obtained more easily through demonstrated transformation methods than with other microalgae, has provided an understanding of various metabolisms such as lipid biosynthesis and carotenoid biosynthesis. The metabolic pathway provided by C. reinhardtii increases the industrial application potential of microalgae. Ettlia sp. YC001 (hereinafter referred to as Ettlia sp.), an indigenous microalga isolated from Daejeon, South Korea, can accumulate various carotenoids depending on the cultivation conditions. This study aimed to increase TAG accumulation via regulation of lipid synthesis metabolism in C. reinhardtii and to increase carotenoid accumulation by heterologous expression of plantderived stress tolerance protein through optimization of the species-specific transformation methods in Ettlia sp. Finally, this study was also carried out to overcome the limitations of the TAG and carotenoid production process through genetic engineering in microalgae. Membrane lipid remodeling in photosynthetic organisms is a stress response mechanism that maintains membrane lipid stability and increases TAG accumulation and is one of the strategies to increase neutral lipids for biodiesel production in microalgae. MGDG, which has a large number of membrane lipids in C. reinhardtii, is important for the proper formation and maintenance of the chloroplasts and thylakoid membrane. This study sought to enhance TAG accumulation by promoting membrane lipid remodeling metabolism by inhibiting the expression of MGD1 synthesizing MGDG with ami-RNA. MGD1 down-regulated mutants not only inhibited the synthesis of MGDG, but also induced ER stress and ROS accumulation. C. reinhardtii promoted membrane lipid remodeling to increase TAG in response to induced stress. Finally, TAG in mutants was accumulated more than eight-fold higher compared to WT, and TAG productivity was increased up to 21 mg/L/d under high light and nitrogen deprivation conditions. Moreover, the fatty acid composition in the mutants showed suitable improvement of biodiesel properties under stress conditions. Through these results, regulation of the membrane lipid synthesis genes could be suggested as a suitable strategy for biodiesel production as well as enhancement of TAG accumulation. Through research in various fields such as culture optimization, material accumulation, and harvesting over the past decade Ettlia sp. has been confirmed to have potential as an industrial microalga. However, despite optimized cultivation conditions, Ettlia sp. showed a limitation of accumulating lipids and/or carotenoids. The development of species-specific transformation methods in Ettlia sp. is necessary for increasing lipid and carotenoid production. Optimized electroporation conditions confirmed that the transformation efficiency was improved at a 5 kV/cm field strength, and genes that were highly expressed according to the cell growth phase through a transcriptome analysis were selected as endogenous promoters. Cyan fluorescence protein (CFP) was introduced into Ettlia sp. using optimized transformation methods, and as a result, CFP was stably expressed in mutants. The developed transformation system with the endogenous promoter using electroporation is simple to prepare, easy to operate with high repetition, and utilizes species-specific vectors for high expression. This system could be used in not only molecular studies on microalgae but also in various industrial applications of microalgae. For enhancing carotenoid accumulation in Ettlia sp., orange protein from sweet potato (IbOr) was heterologously expressed using demonstrated species-specific transformation methods. Orange protein is known to increase carotenoid contents in higher plants and, in particular, IbOr induced β-carotene accumulation. Another goal of this study was to improve stress tolerance under the stress cultivation process as well as increase β-carotene accumulation through IbOr overexpression in Ettlia sp. The mutants showed higher carotenoid accumulation than the wild-type under dual stress conditions of nitrogen deficiency and high light, and increased β-carotene and astaxanthin productivity by 4.74 mg/L/d and 2.78 mg/L/d, respectively. Furthermore, the mutants recovered the Fv/Fm value and reduced the ROS level compared to WT under dual stress cultivation. Therefore, IbOr overexpression in Ettlia sp., keto-carotenoid-producing microalgae, increased the carotenoid flux by maintaining PSY stability under stress conditions, thereby increasing the β-carotene content and the astaxanthin content synthesized from β-carotene. This study presented the first heterologous expression of an orange protein in keto-carotenoidproducing microalgae. In summary, this study enhanced TAG and carotenoid productivity through downregulation of lipid biosynthesis genes and heterologous expression of the higher-plant protein in C. reinhardtii and Ettlia sp., respectively. The strategies suggested in this study, which can increase TAG and carotenoid productivity, are expected to be utilized in industrial applications in microalgae.