Identification of Novel Cell Penetrating Peptides

Abstract

Cell penetrating peptides (CPPs) are defined as short peptides less than 30 residues containing the ability crossing cellular membranes. They can deliver various cargos, including proteins, small molecules, and nanoparticles, inside cells. For this reason, many CPPs have been developed for applications ranging from fundamental to applied biology (cell imaging, gene editing, and therapeutics delivery). Phage display is commonly applied as a method for CPP identification because it has the advantage to select and enrich interested peptides from a peptide library of numerous combinations. In this study, we screened out several CPP candidates by phage display on living cancer cell (Breast cancer cell line, MDA-MB-231) and cancer cell membrane-mimic liposome. To verify the cell permeability of CPP candidates, we employed recombinant EGFP proteins purified from a bacterial expression system, or chemically synthesized fluorescent dye (5-FAM (ahx)) conjugated peptides. Cell penetrating ability of CPP candidates was verified using FACS and fluorescence microscopy. Among them, two sequences (CPP9 and CPP11) showed superior penetration efficiency with good permeability when conjugated with EGFP & 5-FAM (ahx) whereas CPP13 showed cell penetration efficiency when conjugated with anticancer peptide. Here we confirmed that the cell permeability and distribution of CPPs after penetration vary depending on the type of cargo and the conjugation position of CPP. In addition, our CPP discovery strategy offers a versatile approach to discover functional CPPs that can bind/penetrate cells and delivery cargoes into the cytosol/nucleus.|세포 투과성 펩타이드(CPP)는 세포막을 통과하는 능력을 포함하는 30개 미만의 짧은 펩타이드로 정의된다. 그들은 단백질, small molecule, nano particle을 포함한 다양한 화물을 세포 내부에 전달할 수 있다. 이러한 이유로, 많은 CPP가 기초 생물학에서 응용 생물학(세포 이미징, 유전자 편집, 치료제 전달)에 적용하기위해 개발되었다. 파지 디스플레이는 수많은 조합의 펩타이드 라이브러리에서 관심 있는 펩타이드를 선택적으로 증가시킬 수 있는 장점이 있기 때문에 CPP 동정 방법으로 일반적으로 적용된다. 본 연구에서는 살아있는 암세포(유방암 세포주, MDA-MB-231)와 암세포막을 모방한 리포좀에 대한 파지 디스플레이를 통해 여러 CPP 후보서열을 동정했다. CPP 후보서열들의 세포 투과성을 검증하기 위해 세균 발현 시스템에서 정제된 EGFP 재조합단백질 또는 화학적으로 합성된 5-FAM (ahx) 결합 펩타이드를 사용했다. CPP 후보서열들의 세포 투과성은 FACS 분석과 공초점현미경을 통해 검증되었다. 그 중 2개 시퀀스(CPP9, CPP11)는 EGFP & 5-FAM (ahx)와 결합했을 때 우수한 세포 투과성을 보였고 CPP13은 항암 펩타이드와 결합했을 때 세포 투과성을 보였다. 본 논문에서는 화물의 종류와 화물에 대한 CPP의 접합 위치에 따라 CPP의 세포 투과성 및 침투 후의 분포가 달라짐을 확인하였으며, 항암 펩타이드에 적합하지 않은 CPP가 있음을 확인하였다. 우리의 CPP 발견 전략은 세포에 침투하거나 결합할 수 있는 혹은 화물을 세포질과 핵에 전달할 수 있는 CPP 발견의 밑바탕이 될 것이다.