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Multiplex rRT-PCR of 14 respiratory viruses using a point-of-care testing platform

Multiplex rRT-PCR of 14 respiratory viruses using a point-of-care testing platform
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Issue Date
2022. 2
Acute respiratory infections have caused more than 72,000 infections per year in Korea over the past six years and show specifically high mortality rates among children under the age of 5 and older adults with weakened immune systems. Several types of infectious respiratory viruses have been characterized. They are generally difficult to distinguish in practice as they all cause similar clinical symptoms. To provide appropriate treatment and reduce the rates of transmission, viruses have to be diagnosed with sensitive and rapid techniques, such as reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The present study aimed at developing a multiplex real–time RT-PCR (rRT-PCR) detection method targeting 14 respiratory viruses known to have high disease severity and infectivity, namely: influenza A and influenza B viruses, parainfluenza virus (PIV) 1, PIV2, PIV3, PIV4, human metapneumovirus (hMPV), adenovirus (ADV), human rhinovirus (HRV), respiratory syncytial virus (RSV), and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Thus, 14 different primer pair and probe sets were designed based on specific genes (with varying criteria). The method employed a portable PCR device capable of point-of-care testing (POCT) with a multiplex biochip to reduce the PCR test duration and reduce the amount of solution required per reaction by half. To confirm the detection limit of the primer pair and probe sets for each target virus, standard curves were constructed. rRT-PCR experiments were conducted using nucleic acid samples from nasopharyngeal swabs of positively diagnosed patients. The rRT-PCR method was capable of detection at 1.0 × 101 – 1.0 × 102 copy number/rxn of synthetic samples for all primer pair and probe sets, and could effectively detect most nucleic acid samples. This study demonstrated the potential for rapid and accurate respiratory virus detection using the POCT platform based multiplex rRT-PCR analysis method. The innovative assay method described in this study is expected to provide rapid, low-cost, early diagnosis of respiratory viruses. |급성 호흡기 감염은 지난 6년 동안 국내에서 연간 72,000건 이상의 감염을 일으켰으며 특히 면역 체계가 약한 5세 미만 어린이와 노인에서 높은 사망률을 보인다. 여러 유형의 전염성 호흡기 바이러스가 특징지어졌다. 그들은 모두 유사한 임상 증상을 유발하기 때문에 일반적으로 실제로 구별하기 어렵다. 적절한 치료를 제공하고 전파 속도를 줄이려면 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)과 같은 민감하고 신속한 기술로 바이러스를 진단해야 한다. 본 연구는 질병의 중증도와 감염성이 높은 것으로 알려진 14가지 호흡기 바이러스, 즉 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 1, PIV2, PIV3, PIV4, 인간 메타뉴모바이러스(hMPV), 아데노바이러스(ADV), 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 표적으로 하는 다중 실시간 RT-PCR(rRT-PCR) 검출 방법을 개발하는 것을 목표로 하고 있다. 이에 대해 14개의 서로 다른 프라이머 쌍 및 프로브 세트가 특정 유전자(다양한 기준)를 기반으로 설계되었다. 이 방법은 PCR 테스트 시간을 줄이고 반응 당 필요한 용액의 양을 절반으로 줄이기 위해 멀티플렉스 바이오칩으로 현장 진료 테스트(POCT)가 가능한 휴대용 PCR 장치를 사용했다. 각 표적 바이러스에 대한 프라이머 쌍 및 프로브 세트의 검출 한계를 확인하기 위해 표준 곡선을 구성했다. rRT-PCR 실험은 양성으로 진단된 환자의 비인두 면봉에서 추출한 핵산 샘플을 사용하여 수행되었다. rRT-PCR 방법은 모든 프라이머 쌍 및 프로브 세트에 대한 합성 샘플의 1.0 × 101 – 1.0 × 102 copy number/rxn에서 검출할 수 있었으며 대부분의 핵산 샘플을 효과적으로 검출할 수 있었다. 이 연구는 POCT 플랫폼 기반 다중 rRT-PCR 분석 방법을 사용하여 신속하고 정확한 호흡기 바이러스 검출 가능성을 보여주었다. 이 연구에서 설명한 혁신적인 분석 방법은 호흡기 바이러스의 신속하고 저렴한 조기 진단을 제공할 것으로 기대된다.
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