핵자기공명법을 이용한 IgG 항원 Apo B-100 유래 펩타이드(C)의 구조연구 및 2-Ethyl-2-Adamantyl chloroformate의 가용매 분해 반응 메커니즘에 대한 속도론적 연구

Abstract

Part I. Structural Studies of Peptides(C) Derived from IgG Antigen Apo B-100 by NMR Spectroscopy

Apo B-100 protein is found on the surface of LDL in the body and plays an important role as a natural ligand that helps the removal of LDL-cholesterol by combining with the LDL receptor. Cholesterol is removed by catabolism through ligand-receptor binding to cholesterol transported from liver to plasma. However, structural modification of apo B-100 in the inner membrane causes apo B-100 to bind to the scavenger receptor of macrophages without binding to the LDL receptor. This makes foam cells to form plaques inside the blood vessels, causing atherosclerosis. Coronary artery disease like atherosclerosis is caused by various reasons such as obesity, high blood pressure, diabetes, hypercholesterolemia, and provokes serious diseases such as myocardial infarction or stroke. According to previous study, P1 ∼ P302 partial peptides were divided into 7 groups, group A to G. These are classified according to the degree and type of the reacting antibody by ELISA analysis of native apo B-100 and modified apo B-100 oxidized through MDA treatment. In this study, structural analysis was performed on peptide P143 (IALDD AKINF NEKLS QLQTY) and P210 (KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH) of group C, which showed high IgG antibody levels in both native and MDA modified states. For the structural analysis of peptides, 1H NMR, COSY, TOCSY, and NOESY spectrum were used to identify the chemical shift values ​​of hydrogens in the residues and the distance information between hydrogen nuclei through NOE connectivity. NMRViewJ and HANSAT Ver. 2 developed by Excel S/W was used for perfect signal designation. In addition, the DG structure according to MD was determined using HYGEOM and HYNMR that were developed in our laboratory, and the structure was confirmed by comparing with the actual NOESY spectrum and calculated one through NOE back-calculation. At this time, the final structure was determined by executing molecular dynamics until the spectrum obtained through the calculated structure matches the actual spectrum structure. The liquid-phase NMR structures of the peptides were determined based on the chemical shift value and spatial distance information through NMR peak analysis, and the secondary structures of the proteins were verified by checking on the Ramachandran plot. As a result, in the case of P143, β-sheet in Ile[1]-Asn[9] and α-helix structure in Gln[16]-Tyr[20] were found. Also, β-turn in Phe[10]-Glu[12] and pseudo α-helix structure in Lys[13]-Ser[15] were exist. In the case of P210, β-turn in Ser[6]-Leu[9], weak α-helix structure in Gln[11]-Tyr[15], and weak β-sheet in Phe[17]-Glu[20] structure could be ascertained. In addition, it was possible to confirm the distribution of the favored and allowed regions of the β-sheet and α-helix of the corresponding amino acids through the Ramachandran plot. If the structures of the 38 partial peptides of Apo B-100 are identified in both the native states and MDA modified states, it can be used as basic research data for the prevention of atherosclerosis, such as the development of a receptor that can block the oxidized site of apo B-100.

Part II. Kinetic Studies of 2-Ethyl-2-Adamantyl Chloroformate for Solvolysis Mechanism

A study of the reaction mechanism by measuring the rate constant for the solvolysis reaction of 2-ethyl-2-adamantyl chloroformate (2-Et-2-AdOCOCl) was proceed by using the conductivity method in 21 pure solvents and binary mixed solvents. Using the existing method, the substrate was synthesized using 2-ethyl-2-adamantanol (2-Et-2-AdOH) and triphosgene, and the reaction was carried out in an ice bath under nitrogen condition to minimize additional side reactions and decomposition reactions. To identify the synthesized substrate, it was analyzed by IR and NMR. Using the Extended Grunwald-Winstein equation, the sensitivity to the nucleophilicity (l) and the sensitivity to the ionization power (m) of solvents were confirmed. In addition, the kinetic solvent isotope effect was identified compared with the rate constant in the solvent having isotopes, and activation enthalpy and entropy values ​​were obtained by measuring rate constants in four temperature sections. The reaction mechanism was finally identified through the progress of product study using gas chromatography. For 2-Et-2-AdOCOCl, the results of l = (-0.27) ± 0.08, m = 0.60 ± 0.05, R = 0.972 for all solvents, ΔH≠ = 17.3 ∼ 23.6 kcal·mol-1 and ΔS≠ = -6.301 ∼ 0.940 cal·mol-1·K-1 were obtained. Through these results, it was predicted that the ionization process through the CO2 decomposition reaction occurred preferentially under the solvolysis reaction conditions, and then the solvolysis occurred at a very slow rate. In this study, the rate constants for the decomposition reaction could be measured. At this time, since different decomposition rate values ​​were obtained for each solvent, it was considered that the decomposition rate may vary depending on the characteristics of the solvents rather than the decomposition due to the instability of the substrate. Comparison with 1-adamantyl chlorothioformate (1-AdSCOCl) and 1-adamantyl chloroformate (1-AdOCOCl), which have the same tertiary structures, shows that CO2 decomposition preferentially occurs and the ionization process proceeds to form a stable tertiary carbocation. In addition, it could be predicted that the back-side attack reaction is difficult due to the bridgehead structure, making the nucleophilic substitution attack difficult. The stable structure of 2-Et-2-AdOCOCl was selected using the Spartan 20 calculation program, and it was confirmed that the ethyl group is located adjacent to the reactive carbon and may make it hard to proceed nucleophilic substitution reaction. Comparison with 2-adamantyl chloroformate (2-AdOCOCl) and 2-methyl-2-adamantyl chloroformate (2-Me-2-AdOCOCl) showed that the electron donating effect of the ethyl group on the bridgehead atom was relatively strong, leading to further decomposition. Through this study, the reactivity of 2-Et-2-AdOCOCl, which corresponds to the tertiary structure of the alkyl chloroformate, was identified by the rate constants of 2-Et-2-AdOCOCl according to the solvents. This study will expand the scope of research on alkyl chlroformates with various structures and it is thought that the application in the field of organic synthesis of alkyl chloroformates acting as synthetic precursors for peptide protecting groups or prodrugs is possible.|Part I. Structural Studies of Peptides(C) Derived from IgG Antigen Apo B-100 by NMR Spectroscopy

Apo B-100 단백질은 체내에서 LDL 표면에 존재하며, LDL 수용체와 만나 LDL-콜레스테롤의 제거를 돕는 천연 리간드로서 중요한 역할을 한다. 간으로부터 혈장으로 운반된 콜레스테롤을 리간드와 수용체 간 결합을 통해 이화작용을 일으켜 콜레스테롤을 제거한다. 그러나 내막 안에서 apo B-100의 산화 및 구조적 변형은 apo B-100이 수용체와 결합하지 못하고 대식세포의 scavenger 수용체와 결합하게 만든다. 이는 거품세포를 만들어 혈관 내부에 플라그를 형성하고, 죽상동맥경화증을 일으키게 된다. 해당 관상동맥질환은 비만, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증과 같은 다양한 원인들로 인해 발생하며, 심근경색이나 뇌졸중과 같은 질병의 원인이 된다. 이전에 진행되었던 선행연구에서, 천연 apo B-100과 MDA 처리를 통해 산화시킨 변형된 apo B-100에 대한 ELISA 분석으로 반응하는 항체의 정도와 종류에 따라 P1 ∼ P302 부분 펩타이드들을 group A ∼ G 의 7가지 그룹으로 나누었다. 본 연구에서는 IgG 항체 수치가 천연 상태와 MDA에 의해 변형된 상태 모두 높게 나타나는 group C의 펩타이드 P143 (IALDD AKINF NEKLS QLQTY) 그리고 P210 (KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH)에 대한 구조 분석을 진행하였다. 펩타이드의 구조 해석을 위하여 1H NMR 및 COSY, TOCSY, NOESY 스펙트럼을 이용하여 잔기 내 존재하는 수소들의 chemical shift 값을 확인하고 NOE connectivity를 통한 수소 핵간 거리정보를 파악하였다. 완벽한 신호 지정을 위해 NMRViewJ와 Excel S/W를 이용해 개발한 HANSAT Ver. 2를 사용하였다. 또한, 연구실에서 개발한 HYGEOM과 HYNMR을 이용해서 MD에 따른 DG 구조를 결정하였으며, NOE back-calculation을 통해 실제 NOESY 스펙트럼과 비교하여 구조를 확인하였다. 이때 계산된 구조를 통해 구한 스펙트럼과 실제 스펙트럼 구조가 일치할 때까지 분자 동력학을 실행하며 최종 구조를 결정하였다. NMR 피크 해석을 통한 chemical shift 값과 공간적 거리 정보를 기반으로 펩타이드 액상 NMR 구조를 결정하였으며, Ramachandran plot을 확인하여 단백질이 가지는 이차 구조를 증명하였다. 그 결과, P143의 경우 Ile[1]-Asn[9]에서 β-sheet, Gln[16]-Tyr[20]에서 α-helix 구조가 나타났고, 그 외에 Phe[10]-Glu[12]에서 β-turn, Lys[13]-Ser[15]에서는 pseudo α-helix 구조가 존재하였다. P210의 경우 Ser[6]-Leu[9]에서 β-turn, Gln[11]-Tyr[15]에서 약한 α-helix 구조를 확인할 수 있었고 Phe[17]-Glu[20]에서 약한 β-sheet 구조를 확인할 수 있었다. 또한, Ramachandran plot을 통해 해당하는 아미노산의 β-sheet와 α-helix의 favored region과 allowed region에 대한 분포를 확인할 수 있었다. Apo B-100의 38개의 부분 펩타이드에 대하여 천연 상태와 MDA에 의해 변형된 상태에서의 구조 규명이 모두 이루어진다면, apo B-100의 산화를 막고 산화된 부위를 차단할 수 있는 수용체 개발과 같은 죽상동맥경화증 예방을 위한 연구 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.

Part II. Kinetic Studies of 2-Ethyl-2-Adamantyl Chloroformate for Solvolysis Mechanism

21가지 순수 용매 및 이성분 혼합 용매 내에서 전도도법을 이용해 2-ethyl-2-adamantyl chloroformate (2-Et-2-AdOCOCl)의 가용매 분해 반응에 대한 속도상수를 측정하여 메커니즘을 규명하는 연구를 진행하였다. 기존 방법을 활용해 2-ethyl-2-adamantanol (2-Et-2-AdOH)과 triphosgene을 이용하여 기질을 합성하였으며, 추가적인 부반응 및 분해 반응을 최소화하기 위해 질소 조건 하에 ice bath 내에서 반응을 진행하였다. 합성된 기질을 확인하기 위해 IR과 NMR을 사용하여 분석하였다. Extended Grunwald- Winstein 식을 활용하여 용매의 친핵성도에 대한 민감도(l)와 이온화력에 대한 민감도(m)를 확인하였다. 또한 동위원소를 가지는 용매 내에서의 속도상수와 비교해 속도론적 용매 동위원소 효과를 파악하였고, 4개의 온도구간에서의 속도상수측정을 통해 활성화 엔탈피 및 엔트로피 값을 얻어내었으며, 가스 크로마토그래피(Gas chromatography)를 사용한 생성물 연구를 통해 기질의 반응 메커니즘을 규명하였다. 2-Et-2-AdOCOCl은 전체 용매에 대하여 l = (-0.27) ± 0.08, m = 0.60 ± 0.05, R = 0.972을 얻었고, ΔH≠ = 17.3 ∼ 23.6 kcal·mol-1와 ΔS≠ = -6.301 ∼ 0.940 cal·mol-1·K-1의 결과를 얻었다. 이를 통해 가용매 분해 반응 조건 하에 CO2 분해 반응을 통한 이온화 과정이 우선적으로 발생하고, 이후 가용매 반응이 매우 느린 속도로 일어난다고 예측하였으며, 본 연구에서는 분해 반응에 대한 속도상수를 측정할 수 있었다. 이때 용매마다 다른 분해 속도 값이 얻어졌기 때문에 단순히 기질의 불안정성에 의한 분해가 아닌 용매의 특성에 따라 분해 속도가 달라질 수 있다고 보았으며, 본 기질은 용매의 이온화력에 대해 민감하게 작용하며 분해 반응이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 같은 tertiary 구조를 가지는 1-adamantyl chlorothioformate (1-AdSCOCl)와 1-adamantyl chloroformate (1-AdOCOCl)와의 비교를 통해, 안정적인 tertiary carbocation을 형성하기 위해 CO2 분해가 우선적으로 발생하며 일분자성 반응이 진행된다는 것을 알 수 있었다. Spartan 20 계산 프로그램을 이용하여 안정된 2-Et-2-AdOCOCl의 구조를 선정하였고, ethyl기가 반응 탄소와 인접하게 위치하며 친핵성 치환 반응을 어렵게 할 가능성이 있음을 확인하였다. 2-Adamantyl chloroformate (2-AdOCOCl)와 2-methyl-2-adamantyl chloroformate (2-Me-2-AdOCOCl) 와의 비교를 통해 bridgehead atom에 달려있는 ethyl기의 electron donating 효과가 상대적으로 강해 분해를 더욱 일으키기 쉽다는 것을 확인할 수 있었다. 해당 연구를 통해 alkyl chloroformate 중 3차 구조에 해당하는 2-Et-2-AdOCOCl의 용매에 따른 속도상수를 확인하고 반응성을 규명하였다. 이를 통해 다양한 구조를 가지는 alkyl chlroformate에 대한 연구 범위를 확장시키고, 펩타이드 보호기나 전구약물(prodrug)에 대한 합성전구체로 작용하는 alkyl chloroformate에 대한 유기 합성분야에서의 응용이 가능할 것이라 생각된다.