Separation and Analysis of White Blood Cells Using Microfluidic Technology

Abstract

백혈구는 면역반응을 담당하는 세포로, 백혈구를 분석하여 질병을 진단하거나 건강상태에 대한 정보를 얻을 수 있다. 백혈구를 분석하기 위해서는 수 많은 적혈구들 사이에서 분리하는 과정이 필수적이다. 백혈구를 분리하는 기존의 방법들이 원심분리기를 필요로 하고 시간이 오래 걸린다는 단점이 있어, 이를 극복하기 위해 미세유체소자들이 개발되었지만 분리된 백혈구의 순도나 처리량이 낮다는 한계가 있다. 또한, 현장진단검사(point-of-care test)를 위한 백혈구 분석 소자들도 많이 개발 되었지만, 미세유체소자를 구동하고 이미지 데이터를 얻기 위해선 여전히 크고 복잡한 시린지 펌프와 현미경을 필요로 하여, 사용이 제한적이다. 따라서 이러한 한계를 극복하기 위해서 분석을 위한 미세유체소자를 개발함과 동시에, 이를 구동하고 분석하기 위한 소형화된 플랫폼을 개발하는 것이 중요하다. 먼저 고속, 고순도의 백혈구 분리를 위해서, discontinuous slant array (DSA) ridge를 기반으로 하는 백혈구 농축부와 slant, asymmetric (SA) lattice를 기반으로 하는 백혈구 세척부를 하나의 소자에 결합한 미세유체 소자를 개발하였다. 이를 이용하여 백혈구를 분리하였을 때, 순도 97.52 %, 회수율 84.28 %, 세척효율 99.99%, 그리고 처리량은 60 μL/min으로 고속, 고순도로 백혈구 분리가 가능하 였다. 10분 이내에 35만 개 이상의 백혈구가 분리 되었으며, 이는 분리 후 이어지는 면역표현형검사(immunophenotyping)를 하기에 충분한 양이었다. 백혈구 분리에 사용했던 DSA ridge 기반의 미세유체채널과, 세포염색시약을함유한 수화젤을 이용하여서, rWBC를 농축하고 계수하기 위한 미세유체소자를개발하였다. 0.1 rWBCs/μL로 낮은 농도로 존재하는 rWBC를 400 μL/min의 높은 처리량으로 계수할 수 있었다. 그리고 세포염색시약을 함유한 수화젤을 이용해서, 전처리 과정이 없이 rWBC가 미세유체소자내에서 염색이 되었고, 0.71 rWBCs/μL의 농도로 존재하는 rWBC를 계수할 수 있었다. 더 나아가, 기존의 미세유체소자를 구동하고 이미지를 얻기 위해서 필요했던 시린지펌프와 현미경을 대체하고자, 전동 스마트 피펫과 소형화된 현미경을 제작하였다. 전동 스마트 피펫은 219.5 에서 840.5 μL/min의 범위 내에서 유속 조절이 가능하며, 이를 이용하여 혈액내에 0.1 rWBC/μL로 낮은 농도로 존재하는 rWBC를 370 μL/min의 처리량으로 계수할 수 있었다. 중력을 이용한 펌핌시스템을 도입하고 소형화된 현미경을 하나로 결합하여 통합된 시스템을 만들고, 이를 이용하여 백혈구 기능 분석 중에 하나인 호중구 부착 분석(neutrophil adhesion assay)을 진행하였다. 미세유체소자를 기울여 유동을 발생시켰으며, 이 때 작용하는 전단응력은 약 2 dyne/cm2으로 미세유체소자의 유동을 확인하였다. 채널 내부를 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로 코팅하고, 부착성이 있는 세포와 부착성이 없는 세포를 흘려주고 채널 내부에 부착된 세포를 계수하여 분석하였다. 통합된 시스템을 이용하여 세포가 함유된 유체를 일정한 전단응력으로 흘려주고, 세포의 부착 분석을 실시간으로 분석할 수 있음을 확인하였다. 기존에 개발된 현장진단소자들이 갖는 작고 단순하다는 장점에도 불구하고, 이를 구동하고 분석하기 위해 크고 도구들을 필요로 한다는 단점이 있었기 때문에, 이를 해결 하기 위한 소형화된 하나의 통합된 시스템의 개발이 필요했다. 이러한 문제들을 해결하기 위해, 백혈구 분리 소자, rWBC 농축 소자, 이를 구동하기 위한 전동 스마트 피펫, 소형화된 현미경, 그리고 통합된 시스템들이 개발되었고, 이는 본 학위 논문에서 보여진 것 외에도 여러 분야에서의 사용 가능 할 것이라고 생각한다.|WBCs are cells responsible for immune responses, and analyzing WBCs allows disease diagnosis and provides information on health status. Separation from numerous RBCs is essential for WBC analysis. The development of WBC separator is required to overcome the disadvantages of conventional methods, such as time-consuming, requiring centrifuge and the limitations of the microfluidics (e.g. low purity and low throughput). Although the developed WBC analysis devices aimed at point-of-care test (POCT), their use is limited because bulky and complex equipment such as syringe pump, and conventional microscope are required to operate device and acquire image data. Therefore, it is also important to develop a miniaturized platform for operating and analyzing the microfluidic device at the same time as the development of the device. For high-purity, high-throughput WBC separation, I developed an integrated microfluidic device that combines a discontinuous slant array (DSA) ridge-based WBC enrichment unit and a slant, asymmetric microfluidic (SA) lattice-based WBC washing unit. The separation performance was 97.52 %, 84.28 %, and 60 μL/min for purity, recovery, and throughput, respectively, and the washing efficiency was 99.99 %. The device ensures a sufficient number of WBCs (≈0.35 million cells) for downstream immunophenotyping within 10 min. For concentrating and counting rWBC, the microfluidic rWBC counter (mRC), which integrates ridged microchannels for cell enrichment and reagent-containing hydrogel patches for on-chip sample preparation, was developed. The ability of mRC for high-throughput and sensitive rWBC counting was demonstrated by measuring rWBC counts as low as 0.1 rWBCs/μL at a high volume throughput of 400 μL/min. As tested with dye-containing hydrogel patches, rWBCs were fluorescently stained on chip, and the subsequent cell counting (0.71 rWBCs/μL) was successfully performed. Furthermore, I developed the motorized smart pipette and the miniaturized microscope that can be substituted syringe pump and conventional microscope. The motorized smart pipette was able to control the flow rate from 219.5 to 840.5 μL/min. Using the handheld motorized smart pipette and the miniaturized microscope, rWBC present at 0.1 rWBC/μL was successfully counted with as throughput of 370 μL/min. Through this, the usability of handheld, portable microflow cytometry was demonstrated. In addition, the integrated microfluidic system was developed for neutrophil adhesion assay, one of the WBC functional assays. The gravitational pumping system is used in the fluidic system, which rotates an optical part to generate a fluid flow, and a shear stress of approximately 2 dyne/cm2 is applied. After coating the cell adhesion molecule on the channel, the adhesion and non-adhesion cells were flowed, and the cells captured in the channel were counted and analyzed. At this time, real-time imaging was performed to ensure the utility of the cell adhesion assay.