HPV16 E6/E7을 이용한 적혈구 전구세포의 불멸화 연구

Abstract

In vitro culture methods to produce red blood cells (RBCs) have been developed to solve the blood shortage and transfusion-related side effects. However, the amount of generated RBCs in plates is very small due to the limited proliferation rate of progenitor cells. RBC production from pluripotent stem cells also has a very low yield and enucleation rate. Therefore, the establishment of erythroid progenitor cell lines which can proliferate long-term would have more advantages for mass production of RBCs. In this study, CD34+ cells isolated from human cord blood, peripheral blood, and bone marrow were transduced with HPV16 E6/E7 and cultured for more than 57 days in only cord blood-derived hematopoietic stem cells. However, despite the continuous expression of E6, E7 mRNA in long-term cultured cells, the proliferation of immature erythroblast is not continued and the number of cells decreases due to differentiation and apoptosis. When transforming growth factor (TGF)-β inhibitor and Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α agonist were added to the medium, immature erythroblasts (proerythroblasts and, basophilic erythroblasts) were increased compared to the control group. Next, a pro-survival gene, Bcl-xL, was added to the vector to reduce apoptosis. Then, cell viability and proliferation were significantly increased compared to the control group. In addition, when BMI1, involved in the proliferation of erythroblasts, was additionally transduced, long-term culture was possible for more than 160 days. When turning off the transduced genes, immature cells could mature to RBCs. In summary, the overexpression of HPV16 E6/E7 with Bcl-xL and BMI1 established erythroblast cell lines that can conditionally mature to RBCs. In the future cell lines with much higher proliferation power could provide a source of transfusable RBCs.|혈액 부족 현상과 수혈로 인한 감염 가능성, 면역 유발 부작용 등으로 인해 안전하고 지속적인 혈액 공급을 위한 연구가 필요하다. 체외 배양 시스템을 이용해 조혈모세포에서 적혈구 생산기술이 개발되었지만 제한된 증식률로 인해 수혈을 대체할 만한 양의 대량 생산과 지속적 공급에 어려움이 있다. 증식능이 무한한 전분화능줄기세포를 이용한 적혈구 생산은 수득률과 탈핵율이 극히 낮으며 배아형 혈색소의 발현으로 인해 기능면에서 아직 해결해야 할 문제들이 많다. 따라서, 조혈모세포에서 분화시켜 적혈구 전구세포 단계에서 불멸화시킨 적혈구 전구세포주는 배양법이나 분화 면 볼 때 전분화능줄기세포보다 적혈구 대량생산용으로 유리하다. 기존 연구에서 반년 이상 분열하며 탈핵이 가능하다고 보고된 적혈구 전구세포주는 모두 human papillomavirus (HPV) 16 E6/E7 유전자를 과발현하여 제작되었다. 그러나, 모두 같은 벡터를 사용하였고, 발표된 세포주가 몇 개 되지 않는 점을 볼 때 세포주 확립효율이 높지 않음을 알 수 있다. 따라서 더 효율적인 적혈구 전구세포주 확립을 위해 다양한 유전자 발현과 기전을 탐색하고 적절한 배양법을 개발해 향후 적혈구의 대량생산의 기초를 마련하고자 하였다. 본 연구에서는 사람 제대혈, 말초혈액 및 골수 검체로부터 CD34양성세포를 분리하여 세포 불멸화 실험을 진행하였다. 그 결과, 제대혈 유래 조혈모세포에서만 장기간 배양이 되어서 E6, E7 과발현 세포주는 57일 이상의 배양이 가능하였다. 그러나, 배양이 장기화 될수록 미성숙 적아구의 증식이 유지되지 못하고 분화 및 apoptosis로 인해 세포수가 감소하였다. 장기배양된 세포에서 E6, E7 mRNA가 지속적으로 발현되고 있음에도 세포가 급격히 사멸하는 것으로 볼 때, 다른 개선법이 필요한 것으로 판단되어 배양 환경의 개선 및 다른 유전자의 추가 과발현을 실험하였다. 적혈구 전구세포의 증식과 유지에 관여하는 transforming growth factor (TGF)-β inhibitor와 Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α agonist를 초기배양부터 배지에 첨가하였을 때, 미성숙 적아구(전적아구와 호염기적아구)의 비율이 대조군에 비해 증가하였다. 그러나, 미성숙 적아구의 표면에 발현되는 VLA-4 (α4β1 integrin)와 상호작용하여 in vivo 를 mimic할 수 있는 물질로 알려진 fibronectin과의 배양법은 미성숙 적아구의 증식과 유지에 도움은 되지만, 세포주 확립에 유의한 효과를 내지는 못했다. 반면, 장기 증식 중 배양 과정에서 생기는 apoptotic cell이 주변 정상 세포에 주는 영향을 배제하기 위해 시도한 단일 세포 배양법은 일정 세포 수 농도를 유지한 배양 조건 보다 좋은 효과를 보이지 못해서, 세포농도의 유지가 세포주 확립에 필요함을 제시한다. 배양환경 개선만으로는 세포주 확립을 할 수 없어, apoptosis를 줄이기 위해 pro-survival유전자인 Bcl-xL을 vector에 추가하였다. Bcl-xL을 추가 도입한 실험군에서 세포의 생존율과 증식이 대조군에 비해 항상 증가하였다. 또한, 적혈구의 증식에 관여하는 BMI1을 추가적으로 형질도입하여 160일 이상 장기배양이 가능하였다. 따라서 배양법 및 환경을 개선하고 다른 유전자의 추가로 적혈구 전구세포주 확립이 가능함을 확인하였다. 그러나 여전히 비용효율적인 적혈구 생산을 위해 더 높은 효율의 배양법과 기전연구가 추가로 필요할 것이다.