Strategy for the generation of universal donor stem cells by changing HLA-B serotype using CRISPR-Cas9 genome editing

Abstract

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-Cas9 (CRISPR/Cas9), derived from bacterial and archean immune systems, has received much attention from the scientific community as a powerful, targeted gene editing tool. The CRISPR/Cas9 system enables a simple, relatively effortless and highly specific gene targeting strategy through temporary or permanent genome regulation or editing. This endonuclease has enabled gene correction by taking advantage of the endogenous homology directed repair (HDR) pathway to successfully target and correct defective genes. However, advances in regenerative medicine have been hindered by major histocompatibility complex-human leukocyte antigen (HLA) genes, which pose a major barrier to cell- or tissue-based transplantation. My study focused on developing an alternative approach to generate immune-compatible stem cells by replacing the serotype of individual HLA class I genes into patient specific HLA class I gene serotype. I applied CRISPR/Cas9 system to functionally replace the HLA-B antigen presenting cleft from a ‘patient’ cell line into a ‘healthy donor’ cell line. I observed that the HLA-B serotype replaced cell line could functionally express HLA-B surface antigens without affecting the pluripotency nature of the SCNTs. Moreover, the HLA-B serotype replaced stem cells were able to efficiently differentiate into cardiomyocytes and neuronal lineages. Currently this HLA-B serotype replaced cell lines are being evaluated for their immune suppressive activities using patient specific peripheral blood mononuclear cells. In future, I envision that these cells will be grafted in humanized mice models for evaluating successful tissue transplantation without any immune rejection. |세균과 고균 같은 원핵생물 유기체의 게놈에서 발견되는 DNA 서열인 clustered regularly interspaced short palindromic repeat-Cas9 (CRISPR/Cas9)은 강력한 표적 유전자 편집 도구로서 과학계에서 많은 관심 받고 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 일시적 p 또는 영구적인 게놈 조절 및 편집을 통해 간단하면서 비교적 수월하며 고도로 특이적인 유전자 표적화 전략이 가능한 시스템이다. CRISPR/Cas9 은 내인성 상동성 유도 복구 경로를 이용하여 결함 유전자를 성공적으로 표적화하여 유전자 수정을 가능하게 한다. 한편, 세포 또는 조직이식을 가능하게 하는 재생 의학의 발전에도 불구하고, 면역거부반응의 주된 원인인 주조직적합성 복합체-인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자의 불일치는 이식면역 분야에서 아직까지 해결되지 못하고 있다. 본 연구에서는 줄기세포의 HLA 클래스 I 유전자를 이식받고자 하는 환자의 HLA 클래스 I 유전자로 대체하여, 면역 적합성 줄기 세포를 수립하기 위하여 진행되었다. CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 건강한 체세포복제배아줄기세포주 (SCNT)의 HLA-B 유전자를, 이식하고자 하는 대상의 HLA-B 항원 유전자로 대체하였다. HLA-B 항원 유전자가 대체된 SCNT 세포주는 전분화능줄기세포의 다능성 특성에 변화가 없으면서 HLAB 표면 항원을 기능적으로 발현할 수 있음을 관찰하였으며, 심근세포 및 신경 계통으로 효율적으로 분화함을 확인하였다. 현재 이 HLA-B 유전자 대체 세포주는 환자 특이적 말초혈액 백혈구를 사용하여 면역 억제 활성에 대한 평가를 진행하고 있다. 추가적으로 이 세포를 인간화 마우스 모델에 이식하여 면역거부반응이 발생하지 않는 성공적인 조직 이식을 평가하는데 사용될 것이며, 이를 성공적으로 완수하면 면역거부반응을 회피할 수 있는 획기적인 기술로 정립될 것으로 기대한다.