CRISPR-based genome-wide screening for deubiquitinases regulating odontogenesis and osteogenesis

Abstract

탈유비퀴틴화 효소 (deubiquitinating enzymes; DUB)는 분해되는 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 단백질 군이다. DUB 는 세포 신호전달, DNA 복구, 세포 주기 조절 및 줄기세포 분화와 같은 세포 기능에 관여하는 여러 기능적 역할을 수행한다. 포유동물 세포에서 DUB 유전자 결손 모델에 기초한 기능 상실 연구를 통해 DUB 기능을 탐색하기 위한 우수한 모델로 사용할 수 있다. 본 연구에서는 CRISPR-Cas9 을 이용하여 DUB 전체 유전자 세트를 게놈-스케일로 제거한 후, 치아발생 (odontogenesis) 및 골형성 (osteogenesis)에 관여하는 DUB 를 체계적으로 선별하였다. DUB 가 치아발생을 조절하는 기전을 밝히기 위하여 기능손실 기반 스크리닝과 ubiquitin specific proteases (USP) 분석을 통해, paired domain box gene 9 (PAX9) 및 muscle segment homeodomain homeobox1 (MSX1) 단백질의 안정화제로서 USP49 를 발굴하였다. PAX9 및 MSX1 모두 상피에서 중간엽으로 치아발생에에 중요한 역할을 하고 있다.. PAX9 및 MSX1 에서의 유전자 돌연변이는 치아발생을 억제하므로, DUB 에 의한 PAX9 및 MSX1 단백질의 조절은 치아발생 동안 중요한 인자가 될 수 있다. 본연구에서는 PAX9 및 MSX1 단백질의 유비퀴틴화 및 탈유비퀴틴화 조절, 그리고 이들이 발생기전 동안 갖는 중요한 역할을 확인하였다. 또한, USP49 가 PAX9 및 MSX1 단백질과 상호작용하고, 탈유비퀴틴화하며 반감기를 연장한다는 것을 보여주었다. USP49 의 손실은 인간 치수줄기세포의 발생 및 분화를 지연시키고, 인간 배아줄기세포의 신경능선 세포 계통으로의 분화를 지연시킨다. USP49 의 고갈은 석회화된 조직에서 여러 형태학적 결함을 유발하는데, 이는 치아 성장 감소, 에나멜 공간 감소, 비정상적인 에나멜 형성, 불규칙적인 광물화 등이다. 또한, 본 연구에서는 골형성을 조절하는 MSX1 의 단백질 안정화제로 작용하는 탈유비퀴틴화 효소인 USP11 을 발굴하였다. 즉, 골형성 분화 과정에서 USP11 의 탈유비퀴틴화 활성에 의해 MSX1 단백질 회전율, 안정성 및 단백질 분해가 조절됨을 확인하였다. 결론적으로 본 연구를 통하여 밝혀진, 치아발생과 골형성을 조절하는 DUB 의 기능조절이 효과적인 재생의학 치료에 기여하기를 기대한다.|Deubiquitinating enzymes (DUBs) are a family of proteases that remove ubiquitin from proteins undergoing degradation. DUBs play several functional roles other than deubiquitination that is involved in cellular functions, such as cell signaling, DNA repair, cell-cycle regulation, and stem cell differentiation. It can be used as an excellent model for exploring DUB functions through a loss-of-function study based on the DUB gene defect model in mammalian cells. In this study, I used CRISPR-Cas9 to perform genome-scale knockout of the entire set of genes encoding DUBs and then systematically screened for DUBs that involved during odontogenesis and osteogenesis. To provide the proof-of-concept that DUBs regulates odontogenesis, I applied this loss-of-function based screening and identified ubiquitin-specific proteases (USPs), USP49 as a protein stabilizer for both Paired Domain Box gene 9 (PAX9) and Muscle Segment Homeodomain-homeobox1 (MSX1) proteins. Both PAX9 and MSX1 are critical for the transition in odontogenic potential from epithelium to mesenchyme. Genetic mutations in PAX9 and MSX1 cause tooth agenesis, so I hypothesized that the regulation of PAX9 and MSX1 protein levels by DUBs might be crucial factor during odontogenesis. I identified the ubiquitination and deubiquitination regulation of PAX9 and MSX1 protein and the critical role they have during odontogenesis. USP49 interacts with, deubiquitinates, and extends the half-life of PAX9 and MSX1 proteins. Loss of USP49 retards odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells and also delays the differentiation potential of human Embryonic stem cells into the neural crest cell lineage. Depletion of USP49 causes several morphological defects in calcified tissues, such as reduced dentin growth, reduced enamel space, abnormal enamel formation, and irregular mineralization. I also reported USP11, a deubiquitinase acting as a protein stabilizer for MSX1 that regulates osteogenesis. I concluded that MSX1 protein turnover, stability, and protein degradation were regulated by the deubiquitinating activity of USP11 during osteogenic differentiation. Taken together, I hope that the function of DUBs regulating odontogenesis and osteogenesis might aid in the development of effective regenerative medicine to improve clinical care.