Chaperon-mediated autophagy regulates diquat-induced apoptosis

Abstract

α-Synuclein, which is associated with Parkinson’s disease, is cleared by the ubiquitin–proteasome system and autophagy lysosome system. Chaperon-mediated autophagy (CMA) and macroautophagy are major subtypes of autophagy and play a critical role in pesticide–induced α -synucleinopathy. In this study, I explored the role of CMA in diquat (DQ)-induced α-synucleinopathy and characterized the relationship between CMA and macroautophagy in the clearance of pathologic α -synuclein for the prevention of DQ neurotoxicity. DQ was cytotoxic to SH-SY5Y cells in a concentration-dependent manner, as shown by decreased cell viability and increased cytotoxicity. DQ treatment was also found to induce autophagy such as CMA and macroautophagy by monitoring the expression of Lamp2A and microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B (LC3-II) respectively. Following DQ treatment, SH-SY5Y cells were found to have induced phosphorylated and detergent-insoluble α-synuclein deposits, and MG132, a proteasome inhibitor, effectively potentiated both CMA and macroautophagy for preventing α-synuclein aggregation. Interestingly, CMA impairment by Lamp2A-knock down decreased the LC3II expression compared to in DQ-treated cells transfected with control siRNA. In Lamp2-knock down cells, pathologic α-synuclein was increased 12 h after DQ treatment, but there was no change observed at 24 h. In DQ-treated cells, macroautophagy by 3-methyladenine and bafilomycin inhibition increased Lamp2A expression, indicating an increase in CMA activity. In addition, CMA modulation affected apoptosis, and inhibiting lysosome activity by NH4Cl increased apoptosis in DQ-treated cells. An increase in autophagy was confirmed to compensate for the decrease in lysosome activity. Pretreatment with z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor, significantly enhanced the macroautophagy response of DQ-exposed cells without alterations in Lamp2A expression. These results suggest that CMA can regulate DQ-induced α-synucleinopathy cooperatively with macroautophagy, and crosstalk between macroautophagy and CMA plays an important role in DQ-induced cytotoxicity. Taken together, autophagy modulation may be a useful treatment strategy in pesticide-induced neurodegenerative disorders through preventing α-synucleinopathy.|파킨슨병에서의 α-synuclein은 ubiquitin–proteasome system과 autophagy lysosome system (ALP)에 의해서 제거 된다. ALP에는 lysosome 수용체인 Lamp2A를 통한 chaperon-mediated autophagy (CMA)와 phagophore를 형성하는 macroautophagy가 있다. 이들은 살충제 유발 α-synucleinopathy에서 중요한 역할을 한다. 본 연구는 diquat (DQ) 유발 α-synucleinopathy제거에서 CMA의 역할을 확인하고 DQ로 유도된 신경독성을 예방하기 위해서 CMA와 macroautophagy 사이의 관계를 살펴보았다. DQ는 SH-SY5Y 세포에 농도 의존적 ​​방식으로 생존능력 감소 및 독성의 증가를 나타냈다. 또한 본 연구에서는 DQ처리 세포에서 Lamp2A 및 LC3II의 발현을 각각 관찰하여 CMA 및 macroautophagy와 같은 autophagy를 유도하는 것을 밝혔으며, 인산화 및 세척제-불용성 α-synuclein 축적을 유도하는 것을 확인했다. Proteasome 억제제인 MG132를 사용하여 α-synuclein의 응집을 막았을 때 CMA 와 macroauophagy가 강화됐다. 예상했던 바와 달리 Lamp2A 발현 및 기능 억제로 CMA가 손상된 세포는 대조군의 DQ를 처리한 세포와 비교하여 LC3II 발현이 감소되었다. 또한 α-synuclein oligomer들이 축적되었고 세포사멸도 증가하는 것을 보였다. Macroautophagy의 조절을 위해 3MA와 bafilomycin으로 macroautophagy의 유도기 및 lysosome-fusion 단계를 억제하였을 때, CMA 가 증가하는 것으로 나타났으며, 또한 다른 메커니즘으로 인해 macroautophagy를 유도하는 Rapamycin 처리 역시 CMA의 기능을 증가시켰다. 또한, NH4Cl로 lysosome을 억제하면 보상작용으로 Lamp2A와 LC3II 발현이 증가하고 lysosome의 기능 억제로 세포사멸은 증가했다. 마지막으로, ​​z-VAD-fmk를 사용하여 세포사멸을 억제했을 때 macroautophagy는 증가했지만 CMA에는 영향을 미치지 않았다. 따라서 본 연구 결과는 CMA가 macroautophagy와 함께 DQ 유도 α-synucleinopathy를 조절할 수 있고 macroautophagy와 CMA 상호조절이 DQ 유도 세포 독성에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 종합하면, autophagy 조절은 α-synucleinopathy을 예방함으로 살충제 유발 신경퇴행성 장애에서 유용한 치료 전략이 될 수 있다.