Long-term monitoring of neurotransmitters in behaving animal brain via electrochemical technique with sub-minute temporal resolution

Abstract

각종 신경전달물질 중 도파민은 신경세포 간 정보를 전달하고 뇌 회로의 적절한 활동일 주기를 유지하는 중추신경계의 화학적 전달자 역할을 한다. 뇌 내 도파민 농도 조절에 문제가 생기면 운동 기능 장애, 수면 장애, 시각 장애, 감정 조절 실패 등과 같은 증상이 발생하는데 이는 조현병, 뚜렛 증후군, 파킨슨 병 과 같은 뇌 질환에서 흔히 관찰되는 증상들이다. 따라서 뇌의 도파민 변화를 정확하게 측정하는 것은 질병의 전조증상을 파악하고 생체 리듬과 도파민의 관계성을 이해하는데 매우 중요하다. 많은 연구들이 고속스캔순환전압전류법 (FSCV)과 미세투석법을 통해 신경 전달 물질을 측정해왔고 자유롭게 행동하는 동물에서 신경전달 물질의 변화를 측정하여 앞서 소개한 목표를 달성하고자 하였다. 그러나 고속스캔순환전류전압법과 미세투석법은 측정 방식의 한계로 인해 살아있는 동물에서 장기간 도파민 농도를 측정하는데 한계가 있다. 미세투석법은 분석에 걸리는 시간이 길고 측정 전극의 두께가 크기 때문에 조직의 손상이 높으며 공간 분해능이 낮아 동물의 빠른 행동 변화와 도파민의 상관 관계를 분석하기 어렵다. 전기화학적 분석법인 고속스캔순환전류전압법은 미세투석법보다 상대적으로 높은 시공간 분해능을 지니고 있으나, 배경감산법을 이용하여 도파민의 농도를 분석하기 때문에 정확한 기저농도를 측정하는 것이 불가능하다. 더군다나 동물의 뇌에 이식된 탄소전극은 장기간 측정에 사용했을 경우 신호 왜곡이 지속적으로 일어나기 때문에 오랜 기간 사용하는데 있어 한계점을 지닌다. 따라서 본 논문에서는 새롭게 개발된 전기화학 분석법인 다중순환사각전압법 (MCSWV)를 통하여 뇌속의 도파민 기저 농도를 장시간으로 실시간 측정하였다. 이 기술은 높은 시간 분해능(0.05Hz)과 공간 분해능(<7μm)을 갖고 있어 도파민의 실시간 변화를 측정하는데 용이하며, 진상전류를 제거할 수 있어 장기간 측정이 가능하다는 특징을 지니고 있다. 이러한 특징을 통해 본 연구에서는 기존에 연구되지 않았던 자유롭게 움직이는 설치류에서 활동일 주기에 따르는 정량적 도파민의 농도 변화를 측정하였다. 본 연구의 구체적인 목표는 크게 두 가지로 나뉜다. 첫번째는 카본전극과 MCSWV를 이용한 도파민 측정 실험 중에 나타나는 문제점을 확인하고, 장기간 측정이 가능하도록 전극 오염도를 낮출 수 있는 방법을 찾는 것이다. 장기간 측정 가능성이 확인된 후, 실제로 동물실험에 위의 결과를 적용하여 동물의 활동일 주기 동안 나타나는 도파민의 기저농도 변화를 MCSWV를 통해 측정하는 것이 두번째 목표이다. MCSWV를 이용한 실험은 크게 3가지로, 설치류의 도파민 활동일 주기 측정하는 실험, 약물을 통해 뇌 내 도파민 농도와 설치류의 활동성을 변화시키고 이를 분석한 실험, 그리고 MAO 억제제를 이용한 약리학적 실험이다. 위 실험을 통해서 본 연구에서는 자유롭게 행동하는 설치류의 낮과 밤 동안 변화하는 도파민의 기저농도를 성공적으로 추적할 수 있었고, 기존의 측정법에서는 볼 수 없었던 분 단위 미만의 신경 신호의 활동성 변화를 설치류가 활동 중일 때와 수면 중일 때 각각 나누어 관측할 수 있었다. 마지막으로 약물을 통해 변화하는 도파민의 기저 농도 변화를 장기간 측정하여 MCSWV 측정법이 장기간 동물 실험에 사용될 수 있음을 검증하였다. 본 기술들은 향후 다양한 연구에 적용시켜 질병에 따른 행동 변화를 이해하고 치료법을 연구하는 데에 큰 기여를 할 것으로 기대된다. |Among various neurotransmitters, dopamine (DA) serves as a chemical messenger for the central nervous system that transmits information between neurons and maintains appropriate rhythmicity of brain circuits. The dysregulation of controlling phasic firing patterns and tonic concentration of DA in the brain often causes motor dysfunction, sleep disturbance, visual impairment, and mood control failure, common symptoms in brain diseases like schizophrenia, Tourette syndrome, and Parkinson’s disease. Therefore, it is important to monitor the dynamic change of DA in the brain and changes in physical ability to understand the mechanisms involved with behavior and dopamine and identify the early symptoms of those brain diseases. To achieve this goal, neurotransmitter monitoring techniques like fast cyclic voltammetry (FSCV) and microdialysis were often selected to measure the phasic and tonic change of DA from freely behaving animals. However, due to the inherent problems of each measurement technique, FSCV and microdialysis have limitations in measuring quantitative dopamine concentrations in the animal brain for a long time. Microdialysis has a few drawbacks of low temporal resolution (10~20 minute collection periods), high brain tissue damage, and low spatial resolution (< 100 um). For this reason, microdialysis often can’t provide accurate real-time DA information regarding changes in the neurochemical environment which makes it difficult to correlate animal behavior and DA activity during daily cycles. On the other hand, FSCV can detect in-vivo dopamine with relatively higher spatiotemporal resolution than microdialysis (< 7 um, 0.1 seconds), which measures the dynamic change of neural activity with electrochemistry. However, the FSCV technique can’t measure slow basal concentration changes due to the differential method called the background subtraction method. Furthermore, the current signals from chronically implanted carbon electrodes are continuously distorted by biological encapsulation around the electrode surface, making monitoring long-term DA changes with electrochemical techniques challenging. Therefore, in this thesis, the real-time change of in-vivo tonic DA level was monitored through the newly developed electrochemical analysis method, multiple cyclic square wave voltammetry (MCSWV). MCSWV has a sub-minute time resolution (10~20seconds) and high spatial resolution (<7μm), which is suitable to measure the real-time changes of DA in the specific brain area. Furthermore, the capacitive charging currents are eliminated during real-time processing, enabling the long-time measurement of in-vivo DA. With this new technology, we obtained the circadian change of quantitative DA in freely behaving rodents at significantly higher temporal and spatial resolution than other techniques. The specific aim is divided into two parts. The first aim is to minimize the fouling effect on electrodes during the prolonged recording of DA with MCSWV. The chemical and biological fouling was analyzed at the Ag/AgCl-wire reference electrode and carbon-fiber working electrode |respectively. After the possibility of long-term measurement with MCSWV is confirmed, we applied this study to the rodent’s brain to track the basal DA change during sleep and activity for 24 hours. Furthermore, we monitored the sub-minute change of DA firing intensity and animal activity through the DA reuptake blocker. A pharmacological confirmation test was also conducted using MAO inhibitors. Chapter 1 describes the neurotransmitter analysis methods used in previous studies and the background of measuring neurotransmitters in animals for long-term study. Chapter 2 introduces the overall surgical procedures and experimental preparations for long-term dopamine measurement. In chapter 3, we analyzed the electrode sensitivity according to chemical/biological factors during long-term measurement using MCSWV. We introduced the strategies to minimize electrode fouling and prevent electrode performance from decreasing. The last chapter shows the results of long-term dopamine measurement experiments through MCSWV. As a result, we successfully tracked the basal DA response from freely behaving animals in real-time during light and dark transitions and discovered different tonic DA oscillation signals during sleep and awake. The sub-minute temporal resolution of MCSWV provided a new DA signaling pattern, which is expected to contribute greatly to understanding the role of dopamine in behavior and neuropsychiatric disorders.