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Development of label free multimodal microscope for biological imaging using single source and detector

Title
Development of label free multimodal microscope for biological imaging using single source and detector
Author
강주형
Alternative Author(s)
강주형
Advisor(s)
김안모
Issue Date
2021. 8
Publisher
한양대학교
Degree
Doctor
Abstract
생체 조직의 검사를 위하여 많은 현미경 종류가 존재한다. 광학 현미경을 이용한 조직검사는 암 병변, 혈관 병변의 진단 뿐 아니라 여러 진단 분야에서 그 두각을 나타내고 있다. Hematoxylin 과 Eosin을 이용한 H&E 조직 검사는 가장 널리 사용되는 광학 현미경을 이용한 조직검사이다. H&E는 핵을 파란색 그리고 세포외기질을 분홍 색으로 염색을 하여, 병리학자들로 하여금 세포 및 조직의 구분 혹은 병변의 진단에 도움을 줌. 이러한 H&E는 빠른 검사 결과의 획득을 위하여 동결 절편과 함께 많이 사용되고 있음. 그러나 이러한 형광물질을 이용하는 현미경 기술은 생체내 독성을 가지는 형광 물질의 사용 필요로 하고, 절편을 하는 여러 과정을 거쳐야해 생체내 시편의 관찰을 위한 in vivo 조직 검사에는 어려움이 따른다. 그러하여 본 연구에서 여러 비선형 현미경 기술을 합친 다기능 현미경을 개발하였음. 여러 비선형 신호 획득을 통해 형광 물질을 사용하지 않고 조직으로부터 다양한 생화학 및 구조적 정보를 획득할 수 있음. 본 연구에서 사용된 현미경 기술은 Second Harmonic Generation (SHG), Two photon Emission Fluorescence (TPEF), Coherent Anti Stokes Raman Scattering (CARS), Reflectance Confocal Microscopy (RCM) 그리고 Optical Coherence Tomography (OCT)가 있다. SHG,TPEF 그리고 CARS 와 같은 비선형 현미경 기술은 조직의 자가형광 (autofluorescence)를 이용하여 형광물질을 사용하지 않고 조직의 생화학 및 구조적 정보를 얻을 수 있도록 도움을 줌. 반사공초점 현미경 (RCM)은 높은 광학적 절편 기능을 이용하여 높은 분해능으로 조직의 단면 정보를 획득하여 구조적 특성을 보여줄 수 있음. 이를 통해 조직의 생화학 및 구조적 정보를 모두 획득할 수 있는 비선형 다기능 현미경을 개발할 수 있었음. 본 연구에서는 크게 현재 다기능 현미경이 가지는 3개의 문제점을 해결하고자 하였음. 첫째로, 형광물질 사용의 부재로 조직의 낮은 자가형광을 이용한 낮은 SNR 신호의 획득. 둘째, 불연속 신호의 연속적인 검출로 인한 검출 효율 손실, 그리고 이로 인한 SBR의 감소. 그리고 마지막으로 여러 파장으로 이루어진 광원 그리고 emission 신호에 따라 다수의 광원 및 광검출기 사용으로 인해 증가하는 시스템 가격, 사이즈 그리고 복잡성. 본 연구에서는 이 3가지 문제점을 해결하고자 새로운 방법을 제시하고 그에 대한 결과를 보여주었음. 먼저, 형광 물질 사용의 부재로 조직의 낮은 자가형광을 이용한 낮은 SNR 신호 획득에 관한 해결책을 제시하였음. 낮은 SNR은 낮은 형광신호의 세기로부터 오며 비선형 현미경에서 형광신호의 세기는 사용하는 펄스 레이저의 peak power의 제곱에 비례하여 나타남. 그러하여 높은 peak power를 가지는 pulse 레이저 광원을 위하여 peak power와 반비례 관계를 가지는 펄스 반복율을 조절하였음. 이를 통해 높은 SNR의 영상을 획득할 수 있었으며 형광 슬라이드와 같은 슬라이드 샘플, 그리고 조직으로 펄스 반복율에 따른 SNR 증가를 수식적 그리고 실험적으로 증명하였음. 다음으로 펄스 신호의 연속적 검출에 따른 SBR 감소를 영상을 통해 보여주었음. 현재의 검출 방법은 펄스 신호를 연속적 방법으로 획득하여 형광 신호 및 배경 신호를 모두 하나의 영상 pixel 로 변환하고 있음. 이의 경우 원하지 않는 배경 신호가 영상 pixel에 실려 낮은 SBR을 나타나게 됨. Time gating을 이용하여 펄스 신호의 영역에 맞는 검출을 통해 영상의 SBR을 감소할 수 있었음. 마지막으로, 단일 광원과 광 검출기를 이용한 다기능 비선형 현미경 개발을 하였음. Photonic Crystal Fiber (PCF)를 이용하여 단일 광원을 통해 여러 광원을 만들어 줄 수 있었으며 광섬유와 콜리메이터를 이용하여 여러 파장의 다기능 신호를 하나의 광 검출기를 사용하여 획득할 수 있었음. |In microscopy, various techniques exist for investigating biological samples. Optical biopsy utilizes microscopy in diagnosing disease such as cancer and atherosclerosis. Most commonly, Hematoxylin and Eosin (H&E) staining combined with brightfield microscopy is used in pathology. H&E stains the nuclear blue and cytoplasmic parts of the cell pink, which allows pathologists to differentiate between the different parts of the cell. It is most commonly used with frozen sectioning as it can be done quickly, allowing rapid pathological results to be returned during surgery. As for fluorescence microscopy, different fluorophores are used to mark different parts of the cell. However, as the sample is marked with fluorophores, in vivo biopsy cannot be done as the fluorophores may be toxic to the human body. Here, I have developed a multimodal microscope utilizing various microscopic techniques which allow label-free observation of biological samples. Each modality provides different biochemical structural information of the sample which aids in pathological evaluation of the specimen. The techniques include Second Harmonic Generation (SHG), Two Photon Emission Fluorescence (TPEF), Coherent Anti Stokes Raman Scattering (CARS), Reflectance Confocal Microscopy (RCM) and Optical Coherence Tomography (OCT). Nonlinear microscopy technique such as SHG, TPEF and CARS obtain autofluorescence signals of biological specimens, allowing users to obtain biochemical and structural information without the use of exogenous fluorescent markers. RCM provides optically sectioned high-resolution reflectance image of a biological sample while OCT provides axial-in depth image of the biological specimen. The system developed uses optical fiber to cause delay to each modality signal. While the pulse picker reduces the repetition rate of the laser, time difference between excitation and emission pulses become more distinguishable by the PMT being used. Low repetition rate in combination with different length optical fibers to cause different delay for each modality signal, allows the system to obtain multimodal signal using only one PMT whereas other multimodal system requires multiple numbers of PMTs to obtain multimodal signals. In addition, less photo damage is done to the sample due to the low repetition rate used. Photonic Crystal Fiber (PCF) is used to create a secondary stokes beam needed to obtain CARS signal. As a result, the system uses a single laser source and PMT to acquire multiple autofluorescence signal from a biological sample.
URI
http://hanyang.dcollection.net/common/orgView/200000498199https://repository.hanyang.ac.kr/handle/20.500.11754/164020
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GRADUATE SCHOOL[S](대학원) > BIOMEDICAL ENGINEERING(생체공학과) > Theses (Ph.D.)
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