Study on Stabilized Enzymes in Biomineralized Calcium Carbonate

Abstract

Among the materials used for enzyme immobilization, inorganic materials have been shown to preserve enzyme activity and improve practical application in biocatalytic process design. Among inorganic substances, calcium carbonate (CaCO3) is used as a material for enzyme immobilization, and biomineralized CaCO3 microspheres were successfully synthesized in this study. An appropriate immobilization method has been used to obtain high storage and reuse stability of enzymes. Herein, We used CaCO3 biomineral as an immobilization material, and the enzyme was successfully immobilized by two immobilization methods, crosslinking and in situ. The two immobilization methods were compared and analyzed by measuring the activity and stability of the immobilized enzyme. And energy dispersive scanning electron microscopy, elemental analysis, particle size analysis, X-ray spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, and X-ray diffraction analysis were used to analyze the surface, particle size and size distribution, crystal of CaCO3. In addition, by analyzing the surface area, pore size, and volume using the Barrett-Joyner-Halenda adsorption/desorption analysis method, the mesopore space of the CaCO3 was confirmed. In both immobilization methods, the model enzyme Carboxyl Esterase from Rhizopus Oryzae (CE) was used, and the hydrolytic activity of the enzyme immobilized by the two immobilization methods was analyzed with the free enzyme at a wide temperature and pH range. As a result of comparing the relative activity after measuring the activity 15 times during the storage period of 180 days, it was confirmed that about 30 % of the activity was preserved in both immobilization methods. However, when the enzyme was immobilized, it could be observed that the loading, activity and properties differ in the immobilization method. Enzymes immobilized by crosslinking are formed into aggregates and are not leached in the pores of CaCO3, confirming the high stability of the enzyme. In addition, in situ is a methodology similar to encapsulation or entrapment, which ensures that the enzyme structure is preserved without denaturation, and the restriction of mass transfer is relieved. This feature preserved the specific activity (mM min-1 mg-1) and catalytic efficiency (Vmax Km-1) of the two systems, and the in situ method showed about 1.5 and 4 times higher values than the crosslinking method, respectively. This study describes an enzyme system stabilized by crosslinking after being adsorbed in CaCO3 microspheres and the stabilization of CaCO3 assembled with enzyme. The kinetics and efficiency of the enzyme were compared and analyzed. Through these studies, enzyme catalyzed reactions related to biological processes can be applied to various industries. |효소 고정화에 사용되는 소재 중 무기 소재는 효소의 활성을 보존하고 생 촉매 공정 설계에 적용을 향상시키는 것으로 나타났다. 무기소재 중 탄산칼슘 (CaCO3)은 효소 고정화를 위한 소재로 사용되고 있으며, 본 연구에서는 bio-mineralization 된 CaCO3 microspheres를 합성하여 효소 고정화 소재로 사용하였고, 효소의 높은 저장 및 재사용 안정성을 얻기 위해 고정화 방법 중에서 Crosslinking과 In situ의 두 가지 방법으로 고정화하였다. 고정화된 효소의 활성과 안정성을 측정하여 두 가지 고정화 방법을 비교 분석하였다. 그리고 에너지 분산 주사 전자 현미경, 원소 분석, 입도 분석, X-선 분광법, Fourier에 변환 적외선 분광법, X선 회절 분석을 사용하여 CaCO3의 표면, 입자 크기 및 분포, 결정 특성을 분석하였다. 또한, Barrett-Joyner-Halenda 흡착 / 탈착 분석법을 이용하여 표면적, 기공 크기 및 부피를 분석하여 고정화 소재로 사용된 CaCO3의 다공성 구조와 기공 부피를 확인하였다. 두 고정화 방법 모두 Carboxyl Esterase from Rhizopus Oryzae (CE)를 모델 효소로 사용하였고, 고정화된 효소는 가수 분해 활성을 다양한 온도 및 pH 범위에서 free enzyme과 비교하여 효율성을 판단하였다. 180일 저장 기간 동안 15회 활성을 측정한 후 상대 활성 값을 비교 한 결과, 두 고정화 방법 모두 약 30 %의 활성이 보존된 것을 확인하였다. 하지만 효소를 고정화하면 고정화 방법에 따라 로딩양, 활성 및 특성이 다른 것을 관찰할 수 있었다. Crosslinking에 의해 고정화된 효소는 CaCO3 기공 안에서 응집체로 형성되어 효소가 기공 밖으로 침출되지 않기 때문에 높은 안정성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, In situ 고정화 방법은 encapsulation 또는 entrapment와 유사한 방법론으로 효소 구조가 변성되지 않고 보존되고 물질 전달의 제한이 완화된다. 두 고정화 방법 모두 비활성도 (mM min-1 mg-1) 및 촉매 효율 (Vmax Km-1)이 보존되었으며, In situ 고정화 방법이 crosslinking 방법보다 각각 1.5 배 및 4 배 높은 값을 나타냈다. 이 연구는 효소가 CaCO3 microspheres 기공 안에 흡착된 후 crosslinking에 의해 안정화된 고정화 방법과 탄산칼슘이 합성되면서 효소가 고정화되는 In situ 고정화 방법으로 안정화된 효소의 활성 및 효율성을 비교 분석하였다. 고정화된 효소의 효율성과 안정성 연구를 통해 생물학적 공정과 관련된 효소 촉매 반응은 다양한 산업에 적용할 수 있을 것으로 판단된다.