Study of Cell Intrinsic and Extrinsic Controls of Drosophila Hematopoiesis in The Lymph Gland

Abstract

초파리는 성장 과정 동안 총 두 번의 혈구 발생 과정이 있다고 알려져 있다. 첫 번째는 배아 단계에서의 혈구 발생이며 이는 배아 시기의 머리 중배엽에서 시작된다. 이 때 생성된 혈구는 초파리의 유충의 혈 림프로 흘러 들어가게 되어 유충 시기에 면역 기능을 갖는다. 두 번째 혈구 발생은 유충 시기에 림프 글랜드라 부르는 특정 기관에서 일어나게 되며 유충의 성장과 함께 성장한 후 번데기 시기에 혈 림프로 흘러 들어간다. 이렇게 생성된 혈구세포들은 번데기, 성충 시기에 기능을 갖는다고 알려졌다. 림프 글랜드는 크게 3가지 부분으로 나누어져 있다. 수질 영역은 조혈 모세포들로 구성되며 림프 글랜드의 가장 큰 영역을 차지하고 있다. 조혈 모세포들은 초파리 유충이 성장함에 따라 림프 글랜드의 피질 부분으로 분화하게 되는데 이로써 피질 부분에는 3 종류 (플라즈마 세포, 크리스탈 세포, 라멜로사이트)의 분화한 혈구 세포들이 자리잡게 된다. 후방 신호 영역은 조혈 모세포에게 신호를 전달하는 역할을 하며 신호전달을 통해서 조혈 모세포들의 분화 조절을 하게 되는데, 이러한 림프 글랜드의 조혈 모세포 분화 조절 메커니즘을 내 인성 분화 조절 메커니즘이라 한다. 이와 다르게 전신 신호 물질에 의한 조절 메커니즘을 외인성 분화 조절 메커니즘이라 하며 대표적인 예로는 GABA와 인슐린이 있다. 이들의 양이 줄어드는 경우 림프 글랜드 내의 조혈 모세포의 유지가 제대로 일어나지 않아 이른 시기에 혈구가 분화되는 것이 알려졌다. 첫째로 나는 림프 글랜드 내의 혈구 세포의 이질성에 대해 연구하고자 최근에 개발된 개별 세포 유전자 발현 분석법 (single cell RNA sequencing)을 이용하여 림프 글랜드를 구성하고 있는 조혈 모세포 및 분화된 혈구 세포들의 이질성에 대하여 연구하였다. 이를 통해 림프글랜드가 앞서 이야기한 3 부분 이외에 다양한 하위 집단으로 구성된 기관이라는 것을 알게 되었다. 다음으로는 림프 글랜드를 조절할 수 있는 새로운 외인성 혹은 내인성 인자를 찾는 실험을 진행하였다. 외인성 인자로써 dIlp6가 발견되었는데 이는 초파리 유충에서 대기 중의 이산화탄소 농도를 감지하는 신경세포의 활성을 억제하였을 때 림프 글랜드의 크리스탈 세포가 비 정상적으로 증가하는 표현형을 확인함으로써 알게 되었다. 내인성 인자로는 초파리 조혈 모세포에서 발현하는 산화 질소 합성 효소 (Nitric oxide synthase; Nos)의 역할에 대해 연구하였다. 산화 질소 합성 효소는 L-아르기닌과 산소로부터 산화 질소를 생성하는 효소이며 만들어진 산화 질소는 보통 자유 전자 상태로 세포에 존재한다. 하지만 림프 글랜드 내에서 생성된 산화 질소는 자유 전자 상태로 존재하지 않고 칼슘 신호와 함께 특정 단백질에 S-나이트로실화 (S-Nitrosylation)라고 하는 단백질 변화를 일으키는 요소로 작용하였다. S-나이트로실화 된 단백질의 경우 조혈 모세포의 세포 주기를 G2기로 유지하는데 기능이 있었으며 G2기로 세포 주기를 유지함으로써 조혈 모세포의 분화를 억제하는 역할을 갖고 있었다. 추가적으로 조혈 모세포와는 다르게 중간 간세포에서 발생한 산화 질소는 자유 전자 형태로 존재하였는데, 정상적인 발달 단계에서 자유 전자 형태의 산화 질소는 초파리의 수용성 구아닐 고리화 효소 (Soluble guanylate cyclase; sGC)인 Gyc88E에 의해 감지되어 JNK 신호를 활성, 림프 글랜드 내에서 플라즈마 세포가 성숙될 수 있도록 하였다. 위의 연구들을 종합하여 생각해 보았을 때, 초파리의 조혈 기관인 림프 글랜드는 이질적인 집단으로 구성된 혈구 조직이며 환경적 스트레스에 민감하게 전신적, 국소적으로 분화가 조절되는 기관임을 알 수 있었다. |Drosophila blood cells, collectively referred to as hemocytes, are akin to mammalian myeloid cells and primarily function against stress and innate immune-related responses. Blood cells are differentiated from multipotent blood progenitors and consist of at least three representative classes of myeloid cells: plasmatocytes, crystal cells, and lamellocytes. These blood cells are developed in two ways. One occurs in the embryonic stage of the head mesoderm and composes circulating hemocytes. Another wave occurs at larval stages in a specific hematopoietic organ, the lymph gland and composes adult hemocytes. In this study, I found the heterogeneity of lymph gland hemocytes and intrinsic- or extrinsic molecules regulating progenitor cells in the lymph gland. First, the scRNA-seq method was used to establish the heterogeneity of the lymph gland blood cell population. Previously, the classification of lymph gland relied on few marker genes. However, I identified 16 different clusters contained in the lymph glands and found a variety of marker genes for each cluster. Moreover, to compare transcriptome changes under the active immune condition, I performed scRNA-seq to the wasp-infested lymph gland. In addition, I compared transcriptomes of different blood cell lineages to find marker genes that are expressed in one specific blood cell lineage. Second, I investigated systemic molecules that regulate the lymph gland progenitor cell differentiation. I found that ablation of gustatory receptors that detect atmospheric CO2 induces the crystal cell differentiation in the lymph gland. Loss of CO2 sensing neurons increases Sima (Hif) nuclear localization and cytokine expression in the larval brain. Increase in the brain cytokines triggers the fat body JAK/STAT signaling and activates the secretion of a signaling molecule to the lymph gland. Third, I identified that nitric oxide synthase (Nos) is expressed in the lymph gland progenitors, and loss of which leads to precocious differentiation of progenitors. Interestingly, despite the broad expression of Nos, NO in the free radical form is detected only in intermediate progenitor cells and not in core progenitor cells. I found that NO is utilized for post-translational modification of protein targets to promote progenitor cell maintenance. In the intermediate progenitor, free radical NO is detected by the soluble guanylate cyclase and acts on blood cell maturation through cGMP signaling. Collectively, I found: 1) heterogeneity of lymph glands at a transcriptome level, 2) extrinsic factors, and 3) intrinsic factors that regulate the progenitor cell maintenance. My study suggests new insights into the lymph gland development and benefits of Drosophila melanogaster for the study of systemic or intrinsic signaling factors that regulate hematopoiesis.