Rotenone을 처리한 SH-SY5Y 세포에서 PINK1/Parkin 의존성 미토파지에 PGAM5와 CK2의 역할에 관한 연구

Abstract

미토파지 (mitophagy)는 세포에서 기능이 상실된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는데 중요한 역할을 하는 오토파지 (autophagy) 시스템 중의 하나이다. 손상 받은 미토콘드리아의 제거는 파킨슨병의 원인 유전자로 알려진 PINK1 (PTEN-induced putative protein kinase 1)과 Parkin에 의해서 조절이 되는 PINK1/Parkin 의존성 미토파지가 대표적으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 PINK1/Parkin 의존성 미토파지 이외에도 FUNDC1 (FUN14 domain-containing protein 1)과 같은 미토파지 수용체에 의해서 조절이 되는 수용체 매개 미토파지가 밝혀졌다. Serine/Threonine-specific kinase로 알려진 CK2 (casein kinase2)는, mitochondrial phosphatase로 알려진 PGAM5 (PGAM family member 5)와 역으로, FUNDC1의 인산화를 통해 미토파지를 조절한다고 알려져 있다. 하지만 CK2와 PGAM5가 PINK1/Parkin 의존성 미토파지 조절에 있어서 서로 어떻게 영향을 미치는지는 아직 불분명하다. 본 연구에서는 SH-SY5Y 세포에 rotenone을 처리하였을 때 ATP 함량과 세포 생존율의 감소 및 LC3II의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 rotenone이 미토콘드리아 기능 이상 및 미토파지를 유발한다는 것을 의미한다. 또한 rotenone을 처리한 SH-SY5Y 세포에서 PGAM5의 억제 시, 미토파고좀 (mitophagosome)의 형성 및 LC3II, DRP1, PINK1, Parkin의 발현이 대조군에 비해서 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 PGAM5가 DRP1을 매개한 PINK1/Parkin 의존성 미토파지를 조절한다는 것을 의미한다. 또한 PGAM5의 억제 시, p-CK2의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 PGAM5가 미토파지를 조절하는데 있어서 CK2가 간접적으로 이용된다는 것을 의미한다. 또한 CK2 활성 및 발현의 억제 시, LC3II, DRP1, PINK1, Parkin의 발현이 대조군에 비해서 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 CK2 활성 및 발현의 억제가 DRP1을 매개한 PINK1/Parkin 의존성 미토파지를 조절한다는 것을 의미한다. 또한 PGAM5와 CK2 발현 및 기능 억제 시, cleaved caspase-3가 증가된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 PGAM5와 CK2의 발현 억제를 통한 미토파지 억제로 세포자멸사가 증가된 것을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 SH-SY5Y 세포에서 rotenone의 사용이 미토콘드리아 기능 이상 및 미토파지를 유발시킬 수 있고, PGAM5가 CK2를 이용하여 DRP1을 매개한 PINK1/Parkin 의존성 미토파지를 조절 할 수 있다는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 PINK1/Parkin 의존성 미토파지와 수용체 매개 미토파지 사이의 관계에 대한 정보를 제공할 것으로 사료된다.|Mitophagy, or mitochondrial autophagy, is a process that plays a critical role in selective removal of damaged or unwanted mitochondria. The removal of damaged mitochondria is mediated by a pathway consist of PTEN-induced putative protein kinase 1 (PINK1) and the E3 ubiquitin ligase Parkin. In addition to PINK1/Parkin pathway, mitophagy is caused by mitophagy receptor such as FUNDC1. Casein kinase 2 (CK2) is known a serine/threonine protein kinase that phosphorylates FUNDC1 to reverse the effect of PGAM5 in mitophagy activation. However, it is not clear whether the role of CK2 in PINK1/Parkin-mediated mitophagy. In this study, we investigated the role of CK2 in rotenone-induced PINK1/Parkin-mediated mitophagy using SH-SY5Y cells. Rotenone caused an increase LC3II expression, and decreased ATP level, indicating that rotenone causes mitophagy. Also, PGAM5-knocked down cells showed remarkably reduced LC3II, DRP1, PINK1, Parkin expression compared to control cells, suggesting that PINK1/Parkin pathway mitophagy mediated by DRP1 was induced by rotenone. Furthermore, knockdown of PGAM5 reduced the phosphorylation of CK2 at serine 362 (Ser-362) and threonine 360 (Thr-360). Next, we found that knockdown of CK2α significantly blocked the increase of LC3II, PINK1 and Parkin expression in the mitochondrial fraction of rotenone-treated cells. In addition, pre-treatment with CK2 activity inhibitor (TBB) blocked the increase of LC3II, PINK1 and Parkin expression in the mitochondrial fraction of rotenone-treated cells. Furthermore, CK2α-knocked down cells, like PGAM5-knocked down cells, showed that the increase of DRP1 expression in the mitochondrial fraction of rotenone-treated cells was blocked compared to control. These results indicate that inhibition of CK2 activity and CK2α regulates DRP1-mediated PINK1/Parkin-dependent mitophagy. It was also confirmed that PGAM5 and CK2α-knockdown cells showed increased expression of cleaved caspase-3 compared to control cells. These results indicate that inhibition of PGAM5 and CK2α increased cell death. Taken together, we found that rotenone causes mitophagy in SH-SY5Y cells, and that PGAM5 can regulate PINK1/Parkin pathway mitophagy by mediating DRP1 via CK2 activity, phosphorylated. These results are thought to provide information on the additional mechanisms of mitophagy in dopamine neurons.