공유결합으로 고정화된 urokinase 칼럼의 스케일업과 solid-phase refolding에 의한 반복 사용

Abstract

We scaled up a covalent immobilization system of urokinase to the activated Sepharose and used it repeatedly to cleave a fusion protein consisting of human growth hormone and GST fragment. After scale up from 6 ml to 250 mL, the column system still demonstrated basically the same performance in terms of urokinase immobilization and fusion protein cleavage. When the column was washed with 6 M guanidine HCl after the cleavage reaction, the immobilized urokinase showed no activity probably because it was fully unfolded. However, as the denaturant was gradually removed from the column the immobilized urokinase fully regained its bioactivity, which indicated it was properly refolded into its native conformation as covalently attached to the solid matrix. After 20 cycles of this 'solid-phase unfolding/refolding', the immobilized urokinase maintained approx. 80% of the initial bioactivity. This method provides an efficient protocol to apply the solid-phase refolding technique to improve the longevity of immobilized enzyme columns.

Sepharose CL-6B의 기능기를 aldehyde기로 활성화시킨 후 urokinase와 공유결합 시켜 고정화하는 방법을 6 mL 규모에서 250 mL 규모로 스케일업한 결과 고정화 수율 및 고정화된 UK에 의한 절단반응 수율 등에서 스케일업 전후의 결과에 차이가 없었다. 따라서 위의 고정화 방법의 scale-up 효능은 매우 우수한 것으로 나타났다. hGH와 GST 절편으로 구성된 융합 단백질의 고정화 UK 칼럼에 의한 절단 반응 후 용출액의 pH를 3.5로 낮춤으로써 이물질들을 침전시키고 이를 expanded bed chromatography 칼럼에 통과시킨 결과, 이물질들의 제거와 hGH 단량체의 흡착분리가 동시에 이루어졌다. 흡착된 단량체는 NaCl에 의해 용출되었으며 이 단계의 수율은 거의 100%이었다. 따라서 칼럼에 의한 절단 반응과 산 침전에 의한 이물질 침전 반응, EBA에 의한 이물질 제거 및 단량체 회수 반응을 연속적으로 진행할 수 있는 기초를 제시하였다. 또한 고정화된 UK는 guanidine HCl(6 M)을 이용하여 unfolding시키고 이를 세척하여 refolding 시킨 결과 20회의 반복적인 처리 후에도 초기 활성의 약 80% 수준을 유지하였다. 이는 UK가 공유결합된 상태에서 solid-phase refolding이 가능하다는 증거이며, 고정화 효소 칼럼의 수명을 크게 향상시켜 경제성을 확보하는 방안으로 이용될 것으로 기대된다.