Engineering structure and function of multicellular spheroids for tissue engineering

Abstract

조직 공학의 목표는 손상이나 질환에 의해 손상된 조직을 생물학적으로 대체 할 수 있는 3차원 인공 조직을 개발하는 것이다. 3차원 인공 조직 개발을 위한 일반적인 조직 공학적 접근법은 “상향식 (Top-down) 접근법: 생물학적 신호를 포함한 3차원 지지체 제작” 과 “하향식 (Bottom-up) 접근법: 다세포 모듈의 자가 조립 활용법”으로 분류 할 수 있다. 하향식 접근법의 모듈로 활용이 되는 세포 스페로이드는 3차원 구형의 형태를 가진 세포들의 자가 조립에 의한 세포 응집체로 생리학적 조직 환경이 실제 조직과 유사하고 세포의 기능성과 세포-세포/세포-세포외기질 (Extracellular matrix, ECM)간의 상호작용이 2차원 배양된 세포와 비교하여 증가하는 것으로 알려져 있다. 최근 스페로이드는 자발적 융합, 하이드로겔 내에 담지, 3D 바이오프린팅과 같은 기술을 사용하여 3차원 조직체 (연골, 뼈, 기관 등) 형성에 적용되고 있다. 혈관 네트워크 구조를 포함한 복합 구조의 조직이 공배양된 스페로이드들의 융합으로 형성되는 것이 이전 연구에서 이미 확인 된 바가 있다. 그러나, 스페로이드는 다양한 생리학적 특성을 야기할 수 있는 크기의 다양성과 공배양 스페로이드의 구조 제어의 어려움 등과 같은 모듈로써 활용 하기 어려운 한계점을 가지고 있다. 본 연구에서는 조직공학에서 3차원 조직 모듈로써 활용이 가능하고 구조와 기능이 조절된 세포 스페로이드 제작 기법을 제안한다. 일정한 크기의 스페로이드를 대량생산 하기 위해, 온도 감응성 하이드로겔 기판은 폴리 도파민 (polydopamine, PD)을 활용하여 표면에 다량의 마이크로 패턴을 가지도록 하였다. 마이크로 패턴화된 하이드로겔 표면에서 다양한 종류의 세포들 (인간유래 피부섬유아세포, 인간유래 비갑개 간엽줄기세포, 인간 지방 유래 줄기세포, 인간 제대 정맥 내피 세포 등)를 사용하여서 마이크로 크기의 세포 시트 (micro-scaled cell sheet, μCS)를 형성하였고 μCS들은 하이드로겔의 팽창으로 인하여 다량의 스페로이드로 자가 조립 되었다. 게다가, 스페로이드의 크기와 공배양 스페로이드 (줄기세포/내피세포)의 구조는 패턴의 크기와 세포 분주 방법(코어 쉘 구조/혼합구조)에 의하여 각각 조절되었다. 뿐만 아니라, 하이드로겔 내에 담지된 스페로이드의 기능이 하이드로겔의 물리적 특성에 의해 조절이 가능하다는 것이 본 연구에서 확인 되었다. 나아가서, 본 연구에서 제작된 스페로이드는 혈관화된 미세 조직 제작과 조직공학에서 활용이 가능한 스페로이드가 함유된 하이드로겔로서 제작됨으로써 3차원 복합 조직의 모듈로써의 높은 잠재성이 확인 되었다. 그러므로, 본 연구에서 개발된 스페로이드는 조직 공학과 재생 의학 내의 다양한 분야에서 활용이 가능한 유용한 기술이 될 것으로 여겨진다.; Tissue engineering aims to develop 3D artificial tissues that are biologically capable of replacing an injury or a disease tissue. The common approaches for developing 3D artificial tissues are classified into “Top-down”: producing 3D scaffold with biological signals and “Bottom-up”: utilizing multicellular modules assembly. Cell spheroids, employed as a module in bottom-up approaches are aggregation of self-assembled cells with 3D spherical shape, which enhance cell functionality and cell-cell/cell-extracellular matrix (ECM) interaction compared to 2D cell culture methods due to resembling the physiological tissue environment. Recently, the spheroids have been applied to form 3D tissue constructions (cartilage, bone, and trachea) by using techniques such as spontaneous fusion, hydrogel encapsulation, and 3D bioprinting. Previous studies have demonstrated that the fusion of co-cultured spheroids allows the formation of complex tissue containing vascular networks. However, the spheroids as a module suffer from some drawbacks such as difficulty in controlling a structure of co-cultured spheroids and size variation that can cause various physiological properties. In this thesis, I proposed a novel spheroid fabrication approach to make cell spheroids with the regulated structure and functionality to be employed as a 3D tissue module in tissue engineering. For high-throughput production of spheroids with a defined size, micro-patterned, temperature-responsive hydrogel with mussel inspired polydopamine (PD) functionalized surface was prepared. Various types of cells (human dermal fibroblasts, human turbinate mesenchymal stem cells, human adipose-derived stem cells, and human umbilical vein endothelial cells) were used in this study to form a micro-scaled cell sheets (μCSs) on micro-patterned hydrogel, and then the μCSs were assembled into the spheroids with the high-throughput manner through hydrogel expansion process. Moreover, the size of the spheroids and structure of co-cultured spheroids (stem cells/endothelial cells) were controlled by the pattern size and the seeding method (core-shell and mix), respectively. Besides, I found that the functionality of cell spheroids encapsulated in a hydrogel regulated depending on the hydrogel mechanical properties. Furthermore, the spheroids fabricated in this study can function not only as vascularized micro-tissues also a spheroid-laden hydrogel, demonstrating high potential as a complex 3D tissue module. Therefore, the spheroids developed in this study can be promising tools for various applications in tissue engineering and regenerative medicine.