Cell-Specific Delivery of Fusion Protein for Enhanced Therapeutic Effect

Abstract

세포 특이적인 약물 전달은 약물 개발의 궁극적인 목표 중의 하나입니다. 질병에 관여하는 세포나 조직에서 과 발현되는 수용체를 표적 하는 항체의 사용은 세포 특이적인 약물 전달을 가능하게 합니다. Staphylococcus aureus의 세포 표면 단백질인 Protein A는 항체에 결합하여 숙주의 면역시스템으로부터 자기방어를 합니다. Protein A에서 유래된 ZZ 도메인은 항체의 Fc 부위와 결합 가능한 성질을 가지고 있으며, 이는 항체와 약물 간의 어댑터로 사용이 가능합니다. 본 연구에서는 항체-ZZ 재조합 단백질 복합체를 이용한 세포 특이적 약물 전달 및 심근경색 동물 모델에서의 치료 효능 검증을 통해 항체-ZZ 재조합 단백질 복합체 플랫폼을 제시하고자 합니다. 항체를 이용한 약물전달 시스템을 구축하기 위해, 먼저, ZZ 도메인을 이용한 ZZ-TAT-GFP와 ZZ-TAT-Hsp27 형태의 재조합 단백질을 제작하였습니다. ZZ 도메인이 가진 항체와의 결합 여부를 확인하였고, 초기의 항체와 상호작용이 이루어진 후에 다른 항체의 존재 하에서도 기존 결합을 안정적으로 유지한다는 것을 확인할 수 있었습니다. 두번째로, 세포주 수준에서 항체를 이용한 선택적인 약물 전달의 가능성을 확인하였습니다. 앤지오텐신 II 타입 1 수용체, Her2, CD7를 각각 표적 하는 항체를 ZZ 재조합 단백질과 결합시켜 항체 복합체를 구축하였고, 이를 각각의 표적 하는 세포에 처리하여 항체에 따른 표적 특이적 단백질 약물 전달 여부를 검증하였습니다. 마지막으로, 심근경색 동물 모델에서 항체-ZZ 재조합 단백질 복합체에 의한 심근경색 세포 특이적 표적 및 세포 괴사 억제를 통한 치료 효능을 검증하였습니다. 앤지오텐신 II 타입 1 수용체 표적 항체-ZZ 재조합 단백질 복합체 (αAT1-ZZ-TAT-GFP or αAT1-ZZ-TAT-Hsp27 complex)를 심근경색 동물 모델에 정맥주사 하였고, 심장의 허혈 부위에 특이적으로 단백질의 전달 및 전달된 Hsp27에 의한 세포사멸 억제, 섬유증 감소 및 심장 기능 개선의 치료 효과를 볼 수 있었습니다. 따라서, 본 연구를 통해 ZZ 재조합 단백질을 이용한 항체 특이적 단백질 약물 전달체의 구축이 가능하고, 특히 앤지오텐신 II 타입 I 수용체 표적 항체를 사용하여 심근경색 치료제로서의 응용이 가능함을 알 수 있습니다. 더 나아가, 표적 하고자 하는 세포나 조직에 특이적인 항체의 사용함으로써 다양한 질병 치료를 위한 표적 약물 전달체로의 사용을 기대할 수 있습니다.; Delivery of therapeutic molecules (gene, protein and drug) to specific target cells has been a valuable delivery system for biological and medical research. Targeted delivery of drug has been accomplished by conjugating therapeutic drug with cell-targeting moiety. Antibody-mediated drug delivery enable the selected targeting to the desired cells or tissue by using specific antibodies, and it is also possible to deliver the protein drug systemically. Cardiovascular diseases (CVDs) including ischemic heart disease, cerebrovascular disease, and rheumatic heart disease is the main global cause of death. Especially, myocardial infarction (MI) is the most common case of ischemic heart disease and occurs when the amount of blood flow into the heart decreases or stops. As a result, it leads to heart cell death or damage. To reduce cell death by apoptosis mechanism, an increase of heat shock proteins (Hsps) in cardiomyocytes is a normal response to promote tolerance. The heat shock protein 27 (Hsp27) is used as the therapeutic option for the treatment of myocardial infarction because it has protective effects on hypoxia-induced apoptosis. Despite effective anti-apoptotic efficiency, the limit of strategies to deliver Hsp27 to the infarcted heart in vivo makes clinical applicability difficult. In this study, I applied the immunoglobulin (IgG) binding dimer ZZ, which is a modified domain of protein A, in conjunction with the cell specific antibody. The ZZ domain was fused with the Hsp27 protein which can protect the cells from the apoptosis pathway. In this study, antibody-ZZ fusion protein complex was generated by using cell specific antibody. This antibody-ZZ fusion protein complex was able to deliver the therapeutic protein Hsp27 into target cells, resulting in the protection of cells against apoptosis induced by CoCl2. Furthermore, an approach using the AT1 antibody enabled specific delivery of Hsp27 to cardiomyocytes rescued cells from apoptosis in the area of fibrosis and improved cardiac function in the myocardial infarction-induced rat model. First of all, I generated ZZ fusion proteins to construct the antibody-mediated platform. The ZZ domain is known as the immunoglobulin binding dimer, which is a modified domain of protein A. I investigated the binding and competition assay using ZZ fusion proteins and IgG antibody to confirm the possibility of binding to the antibody. Second, I utilized the AT1 antibody-ZZ fusion protein complex to target infarcted cardiomyocytes. Using AT1 antibody-ZZ fusion proteins, I confirmed the cardiomyocyte-targeted delivery of the therapeutic protein and an anti-apoptotic effect of Hsp27 in the induced ischemic condition. Additionally, I investigated the flexibility of the ZZ fusion protein by replacing the antibody to selectively target the desired cells or tissue. Finally, I investigated the treatment effect of the αAT1-ZZ-TAT-Hsp27 complex on a damaged heart caused by myocardial infarction (MI). In the MI-induced animal model, systemically administered αAT1-ZZ-TAT-GFP complex were specifically delivered to the damaged heart region. Also, ZZ-TAT-Hsp27 complexed with αAT1 antibody showed not only the anti-apoptotic effect but also the recovery effect on poor cardiac function caused by MI. In these studies, I provide evidence that the αAT1 antibody can be used to target MI-induced-cardiomyocytes and that the ZZ-TAT-Hsp27 fusion protein complex with αAT1 antibody could be applicable as a therapeutic system for myocardial infarction. Further, I demonstrated that the antibody-mediated delivery system using the ZZ fusion protein can be used as a universal platform to selectively deliver the therapeutic protein by replacing the targeting antibody (Figure 1).