왼온엉덩동맥에서의 짧은 허혈과 재관류 횟수에 따른 흰쥐 신장에서의 전염증성 사이토카인의 발현 변화

Abstract

허혈 및 재관류시 나타나는 염증 작용은 내피세포의 활성과 손상을 증가시키고, 내피세포에 백혈구의 부착을 강화시키며, 미세혈관의 혈류를 약화시킨다. 염증 작용에서 중심 역할을 하는 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β는 I-κB kinase의 활성을 유도하여 NF-κB와 I-κB를 분리시키고, 분리된 NF-κB는 세포질에서 핵으로 이동하여 TNF-α, IL-1과 세포간부착분자인 ICAM-1의 전사를 일으킨다. 상향조절된 ICAM-1은 백혈구를 내피세포에 부착시켜, 조직내 염증세포의 과도한 침착을 유도하여 세포 손상을 가중시킨다. 허혈양상화는 허혈 및 재관류에 의한 손상을 줄이기 위하여, 수술 전에 치명적이지 않은 짧은 허혈과 재관류를 반복하는 처치이다. 최근에 알려진 원거리 허혈양상화(remote ischemic preconditioning)는 국소부위에 허혈양상화를 처치하여 멀리 떨어진 장기를 허혈 및 재관류 손상으로부터 보호하는 현상을 말한다. 그러나 이전 실험에서, 너무 많은 횟수의 허혈양상화를 처치하는 것은 조직이나 개체에 유익하지 않은 효과를 주는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 과도한 염증 반응에 의해 나타난 것으로 생각되며, 본 연구에서는 짧은 허혈 횟수의 증가와 재관류 경과시간이 NF-κB와 전염증성 사이토카인, 세포간부착분자의 발현 변화에 어떠한 영향을 주는지 알아보았다. 35주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하여 대조군과 허혈양상화군으로 나누었고, 허혈양상화 처리는 왼온엉덩동맥에서 5분 허혈과 5분 재관류를 3회, 6회, 10회 실시하였다. 실험동물을 재관류 직후와 3시간, 6시간, 24시간, 72시간 경과시 희생시켜 왼쪽 신장을 적출하여 세포자멸사 정도를 비교분석하기 위하여 세포자멸사 염색을 하고, NF-κB, TNF-α, IL-1β, ICAM-1 단백질에 대한 면역조직화학염색과 Western blot 분석을 하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 허혈양상화군에서 짧은 허혈과 재관류 횟수가 증가될수록, 재관류 24시간부터 사망률이 높아졌다. 2. NF-κB는 재관류 0시간부터 24시간까지는 허혈양상화를 10회 처리한 군에서 가장 높게 발현했으나, 72시간에서는 3회군에서 가장 높게 발현하였다. 3. TNF-α는 재관류 0시간과 6시간, 24시간, 72시간에서는 허혈양상화를 10회 처리한 군에서 가장 높게 발현했으나, 3시간에는 모든 허혈양상화 처치군이 비슷한 면역반응을 보였다. 4. IL-1β와 ICAM-1은 모든 재관류 시간에 허혈양상화를 10회 처리한 군에서 가장 높게 발현하였다. 5. 바깥속질에서의 세포자멸사는 모든 재관류 시간에 허혈양상화를 10회 처리한 군에서 가장 컸다. 이상의 실험결과로 왼엉덩동맥에서의 3회와 6회 허혈양상화 처치가 흰쥐 신장에서 허혈 재관류 손상에 관여되는 NF-κB와 TNF-α, IL-1β, ICAM-1의 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있었으나, 10회의 허혈양상화 처치는 오히려 NF-κB와 TNF-α, IL-1β, ICAM-1의 발현을 증가시켜 허혈손상을 증가시키는 것으로 생각된다.; In renal ischemia and reperfusion injury, the inflammatory response results in endothelial activation and injury, enhanced endothelial cell-leukocyte adhesion, and a compromise in microvascular blood flow. Pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1 activates a multi-protein IκB kinase (IKK) complex. Activated IκB kinase leads to a dissociation of NF-κB and IκB. Once IκB is dissociated, NF-κB translocates to the nucleus and induce transcription of TNF-α, IL-1, ICAM-1 genes. Upregulated proinflammatory cytokines and intercellular adhesion molecules induce increase of inflammation and cell damage. Ischemic preconditioning is a process by which brief periods of ischemia and reperfusion induce a state of protection against a sustained ischemic insult. Recently, remote ischemic preconditioning method which results in transient tissue ischemic at a distance may confer subsequent protection of organ subjected to potentially lethal ischemia. However, in the previous experiments, excessive remote ischemic preconditioning resulted in harmful effects in the tissues or individuals. presumably caused by excessive inflammtory responses. The purpose of this study was to investigate the changes in NF-κB and proinflammatory cytokines expression following courses of reperfusion after various cycles of ischemic preconditioning in the rat kidney. Thirty five weeks old Sprague Dawley rats were subjected to 3, 6 and 10 cycles of ischemic preconditioning that composed of 5 min ischemia and 5 min reperfusion at the left common iliac artery using rodent vascular clamp. The left kidney obtained after 0, 3, 6, 24 and 72 hours of reperfusion followed by each cycle. The expression patterns of apoptosis, NF-κB, TNF-α, IL-1β and ICAM-1 were detected by TUNEL assay, immunohistochemical staining and Western blotting methods. The results were as follows; 1. In the ischemic preconditioning group, the mortality increased from 24 hours after reperfusion when cyclic episodes of short ischemia and reperfusion were increased. 2. The highest level of NF-κB expression in rat kidney outer medulla from 0 hr to 24 hrs of reperfusion is detected after 10 cycles of ischemic preconditioning. The highest level of NF-κB expression at 72 hrs of reperfusion is revealed after 3 cycles of ischemic preconditioning. 3. The highest level of TNF-α expression in rat kidney outer medulla at 0 hr and 6, 24, 72hrs of reperfusion is shown after 10 cycles of ischemic preconditioning. After 3 hrs of reperfusion, all ischemic preconditioning groups shows similar expression. 4. The highest level of IL-1β and ICAM-1 expression in rat kidney outer medulla is observed at all of reperfusion times after 10 cycles of ischemic preconditioning. 5. The highest level of apoptosis in rat kidney outer medulla at all of reperfusion times is shown after 10 cycles of ischemic preconditioning. In conclusion, 3 or 6 times of remote ischemic preconditioning in the common iliac artery could reduce the expression of NF-κB, TNF-α, IL-1β, and ICAM-1, which are associated with ischemia-reperfusion injury in kidney. However, more than 10 times of remote ischemic preconditioning increased ischemic reperfusion injury, caused by increases in NF-κB, TNF-α, IL-1β, and ICAM-1 expressions.