에스트로겐 비의존성 인체 유방암 세포주에서 Decursin의 Akt 신호전달 억제를 통한 in vitro와 in vivo 종양 억제 효과에 대한 연구

Abstract

The need for development of an effective therapeutic agentto estrogen receptor (ER)-negative breast cancer cells has been recognized because they are more aggressive and resistant to conventional hormonal therapy. Decursin((S)-8,8-dimethyl-2-oxo-7,8-dihydro-2H,6H-pyrano(3,2-g) chromen-7-yl3-methyl-2-butenoic acid), a naturally existing coumarin compound originated from the root of Korean angelica, has been shown to possess therapeutic potential in various cancers including prostate cancer and leukemia. Thus, we tested the anti-tumor effect of decursin in ER-negative breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and SK-BR-3, which overexpress epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-ErbB2, respectively. Cell growth was attenuated by decursin (50-200μM) in a time- and dose-dependent manner. Under these conditions, apoptosis was induced as evidenced by increased sub G1 population, enhanced nuclear fragmentation, up-regulation of Bax and cleaved Bid proteins, down-regulation of Bcl-2 protein. Decursin also affected signaling pathways involvedin cell growth and proliferation. The expression of membrane receptors, EGFR and c-ErbB2, were reduced and their downstream effectors, Akt and Erk, were also downregulated as evidenced by reduced phosphorylated proteins. Suppressed Akt activity was seen by reduced phosphorylation of its substates, Bad, p27Kip1 and GSK-3β Total expression of Bad was also enhanced and such changes in Bad may have contributed to augmentedapopotosis by decursin. On the other hand, increased nuclear localization of p27Kip1 was observed, which was consist with reduced phosphorylation at T157 and may have provided for attenuated cell proliferation. Total β-catenin protein as well as Cyclin D1 protein and mRNA were reduced. Moreover, cytoplasmic localization of β-catenin was increased. Therefore, these results strongly suggest the suppression Akt-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway by decursin. Finally, the in vivo anti-tumor effect of decursin was seen in the mouse xenograft model. When MDA-MB-231 or SK-BR-3 cells were engrafted into nude mice by subcutaneous injection, tumor growth was significantly reduced in decursin-administered mice orally for 28 days. By showing the anti-cancer effect of decursin both in vitro and in vivo and suggest cell cycle arrest and apoptosis as a molecular mechanism, our novel findings provide decursin as a potential preventive or therapeutic agent against the more aggressive ER-negative breast cancers through reduced Akt activity and downregulation of EGFR and c-ErbB2.; 에스트로겐 비의존성 인체 유방암은 호르몬 치료에 있어 내성을 나타내므로 더욱 효율적인 치료제 개발이 필요하다. 당귀(angelica)의 뿌리에서 유래한 Decursin((S)-8,8-dimethyl-2-oxo-7,8-dihydro-2H,6H-pyrano(3,2g)chromen-7-yl 3-methyl-2-butenoic acid)은 전립선과 백혈병 암 세포 주에서 항암 치료제로서의 가능성이 보고된 바 있다. 이에 본 연구에서는 EGFR과 c-ErbB2를 과발현하는 MDA-MB-231와 SK-BR-3 에스트로겐 비의존성 인체 유방암 세포주를 사용하여 decursin의 항암 효과를 연구하였다. Decursin을 유방암 두 세포주에 처리 시, 시간에 따른 세포수의 증가가 시간 및 농도의존적으로 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다. 이는 부분적으로 세포사멸의 증가에 기인하였으며, 세포사멸에 관여하는 pro-apoptotic Bax의 발현 증가와 anti-apoptotic Bcl-2의 발현 감소를 확인하였다. 또한 decursin은 세포의 성장과 증식에 관여 하는 신호전달체계에도 효과가 있었다. 에스트로겐 비의존성 인체 유방암 세포들의 성장인자 수용체인 EGFR과 c-ErbB2의 활성과 발현이 decursin에 의해 농도의존적으로 감소 하였으며, 그 하위 단계 단백질인 Akt 와 Erk의 활성 및 발현 또한 감소하였다. Akt의 활성 감소로 인해 pro-apoptotic 단백질인 Bad의 인산화가 감소하였고, Cdk의 억제인자인 p27Kip1의 핵 내 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 GSK-3β의 활성이 감소하고, β-catenin의 발현이 감소하였으며, 세포 주기 조절 인자인 Cyclin D1의 발현이 감소하는 것으로 보아, Akt에 의해 매개된 canonical Wnt 신호전달체계가 억제되었음을 유추할 수 있었다. In vitro 실험 결과를 바탕으로 in vivo 실험인 xenograft 실험 결과 농도 의존적으로 종양 생성이 억제 되었고, 실험동물군의 체중이 변화가 없었으므로 decursin의 유독성에 인한 것이 아님을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서는 decursin이 에스트로겐 비의존성 인체 유방암에 대한 예방 및 치료제로서의 가능성을 제시하였다.