Phospholipase D1 의 neurogenin1 조절을 통한 H19-7 해마 세포주의 신경분화 기전 연구

Abstract

Phospholipase D (PLD)는 포유류 세포에서 다양한 생리학적 신호전달에 관여하는 인지질 분해효소로서 인지질 말단의 diester 결합을 가수분해하여 인지질을 Phospahtidic acid (PA) 와 free choline 으로 전환시킨다. PLD 에 의해 생성된 PA 또한 그 자체로 세포의 증식, 분화, 세포생존 등의 다양한 생리학적 신호전달에 관여한다. 본 연구에서는 PLD1 이 신경발생에 있어서 중요한 역할을 하는 basic helix-loop-helix (bHLH) family 전사인자인 neurogenin1 (Ngn1) 의 활성을 mammalian target of rapamycin (mTOR) 을 경유하여 조절함으로서 H19-7 세포주의 신경발생을 조절한다는 것을 규명하고자 한다. 본 실험실에서 선행된 연구에서 PLD1의 활성이 신경줄기세포의 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 보고한 바 있다. 또한 PLD1 발현 억제 유전자인 dominant negative mutant PLD1 (DN-PLD1) 을 tranfection 시키면 basic fibroblast growth factor (bFGF) 에 의해 유도된 H19-7 세포주의 신경발생이 억제 됨을 통해 신경발생에 있어서 PLD1의 발현과 활성이 중요하다는 것을 확인하였다. PLD1의 활성이 신경분화가 일어나게 되면 발현되는 신경분화 전사인자인 Ngn1의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위해 DN-PLD1을 transfection 시켰으며, Ngn1의 발현 정도를 확인한 결과 bFGF 에 의해 PLD1의 활성이 증가하면 Ngn1의 발현이 증갛였고, PLD1의 활성이 억제 되면 Ngn1의 발현 역시 억제됨을 확인하였다. 이는 통해 Ngn1의 발현이 PLD1에 의해서 조절된다는 것을 밝혀냈다. PLD 의 대사산물인 PA는 mTOR 를 직접적으로 activation 시키는데, mTOR 역시 포유류 세포에서 다양한 생리학적 신호전달에 관여한다. PLD1 에 의한 Ngn1의 발현 조절에 있어서 mTOR 이 관여하는지 확인하기 위해 PLD1-siRNA를 transfection 시켜 PLD1을 knock down 시킨 후 mTOR 과 Ngn1 의 발현을 확인하였다. 그 결과, PLD1의 활성이 증가하면 mTOR 와 Ngn1 의 발현 이 증가하였으며, PLD1이 억제되면 mTOR 와 Ngn1 이는 함께 억제되었다. 이는 PLD1에 의한 Ngn1의 조절에 있어서 PLD1의 하위에서 mTOR 가 관여한다는 것을 암시한다. PLD1이 mTOR 을 경유하여 Ngn1 을 조절한다면 mTOR 을 억제 시키면 Ngn1의 발현도 억제 될 것이며 신경분화 역시 억제 될 것이다. 이를 확인하고자, mTOR inhibitor 인 rapamycin 으로 mTOR 을 block 시킨 후 bFGF 를 처리하였다. 그 결과, 신경 발생의 형태학적 변화도 관찰되지 않았으며, Ngn1의 발현 역시 완벽히 억제됨을 확인하였다. 본 연구에서 확인한 결과들을 통하여 PLD1의 발현과 활성이 bFGF에 의해 유도된 해마 신경 세포주 유래의 H19-7 cells 의 신경 분화에서 중요한 역할을 하며, PLD1은 mTOR 을 경유하여 신경발생에 있어서 중요한 역할을 하는 Neurogenin1을 조절함으로써 신경 분화에서 중요한 역할을 한다고 사료된다.; Phospholipase D (PLD) catalyzes the hydrolysys of phospholipids, mainly phosphatidylcoline (PC), resulting in formation of phosphatidic acid (PA). PA has been associated with many aspects of mammalian physiology, which include cell proliferation, survival, transformation, progression and differentiation. Recently, PA has been identified as a mitogenic activator of mTOR signaling pathway. PA binds to mTOR to promote various signals. We previously verified that PLD1 activity is upregulated during neuronal differentiation induced by basic fibroblast growth factor (bFGF) treatment in rat neuronal hippocampal progenitor cell line, H19-7 cells. Subsequently, we investigated the role of PLD in neuronal differentiation, specifically activation of neurogenin1 (Ngn1), bHLH family which plays critical role in regulation of neural stem cell differentiation. To figure out the effect of PLD1 on Ngn1 through mTOR signal, we treated natural PA to H19-7 cells under differentiation condition. Natural PA treatment upregulated mTOR and Ngn1 expressions. Furthermore, inhibition of PLD1 activity by PLD1 siRNA showed that expressions of mTOR and Ngn1 were completely inhibited. However, mTOR and Ngn1 expression levels were upregulated when PLD1 activity was increased by bFGF in H19-7 cells. To further confirm the role of PLD1 on Ngn1 through mTOR, we treated rapamycin to inhibit mTOR signal. Treatment of rapamycin showed completely inhibited Ngn1 expression and neurogenic morphological change. These results suggest that PLD1 regulate Ngn1 through mTOR signaling pathway during neuronal differentiation in H19-7 cell. This is important evidence that PLD1 regulates neuronal differentiation by producing PA to promote mTOR signaling and stimulate neurogenin1