Nurr1에 의해 유도되는 도파민 신경세포 분화에 서로 다른 역할을 하는 bHLH 전사인자 활성 도메인 규명에 관한 연구

Abstract

도파민 신경세포는 중추신경계에서 중뇌에 존재하며, 운동과 감정을 조절하는 기능을 한다. 파킨슨병은 중뇌의 도파민 신경세포가 결손 되었을 때 발병한다. 아직까지 근본적인 치료법은 없으며, 세포이식이 유일한 방법이다. 세포이식을 하기 위해서는 다량의 도파민 신경세포가 요구된다. 신경줄기세포는 여러 단계를 거쳐 다양한 종류의 도파민 신경세포로 분화한다. 그 과정에서 전사인자(transcription factor)가 작용하여 전사를 조절하여 특정 세포로 분화하게 된다. 도파민 신경세포의 생성, 유지에도 orphan nuclear receptor Nurr1이 필수적이다. 이에 따라 본 연구에서는 Nurr1을 활성화시키는 물질을 찾아 도파민 신경세포의 결손에 의해 생기는 파킨슨병을 치료하고자 각 신경세포 발달 및 분화에 중요한 역할을 하는 전사인자 중에서 활성 도메인을 규명하고자 하였다. 전사 인자 중에서 basic helix-loop-helix(bHLH) 유전자들은 척추동물의 신경발생에 중요한 역할을 한다. Basic helix-loop-helix(bHLH) 전사인자는 기능에 따라 분류된다. 그 중 Class II 는 조직 특이적 활성물질로써 E protein 과 heterodimer를 형성하여 세포 운명을 결정한다. 본 연구는 bHLH 전사인자 중 Class II에 해당하며 Drosophila의 Achaete-scute 와 상동유전자인 Mash1 과 atonal-related 유전자인 Ngn2를 이용하여 활성 도메인 규명을 위한 실험을 진행하였다. Mash1 와 Ngn2는 발생 초기 단계에서 neurogenesis를 조절하는 역할은 동일 하지만 Mash1은 Nurr1에 의해 유도되는 도파민 신경세포의 형태적, 기능적 분화를 유도하는 반면 Ngn2는 Nurr1에 의해 유도되는 도파민 신경세포를 거의 완벽하게 억제한다. 어떠한 도메인이 이러한 기능상의 차이를 나타내는지 알아보기 위하여 각종 chimera 조합을 제작하여 실험을 진행하였다. 선행된 연구에서 bHLH 전사인자 구조에서 활성을 나타내는 부위가 basic 부위가 아닌 Helix-loop-helix(HLH) 부위에 존재 할 것 이라는 결과를 토대로 Mash1과 Ngn2의 HLH 부위에서 특정 부분만을 서로 바꾸어 Mash1(Ngn2), Mash1(Ngn2 HLH), Mash1(Ngn2 H1), Mash1(Ngn2 H2), Ngn2(Mash1), Ngn2(Mash1 HLH), Ngn2(Mash1 H1), Ngn2(Mash1 H2) 8가지의 각 조합의 chimera를 만들어 활성 도메인을 확인하는 실험을 진행 하였다. Spragu Dawley(SD) 흰쥐의 14일 된 배아로부터 cortex cell 을 적출하여 신경줄기세포를 분리 배양하여 Nurr1 과 특정 부분만을 바꾼 chimera virus를 함께 과발현한 후 Immunostaining, promoter assay, western blot, RT-PCR 를 통하여 TH 발현을 관찰하였다. 그 결과 Ngn2 의 TH 억제 특성이 Mash1(Ngn2 H1)에서 나타나고 Mash1(Ngn2 H2)에서는 나타나지 않는 것으로 보아 Helix 1 부분이 기능을 나타낼 것이라 예상되지만, Ngn2(Mash1 H1) 와 Ngn2(Mash1 H2)에서의 TH발현이 거의 차이가 없는 경향으로 보아 Helix 1, Helix 2 두 부분이 기능을 나타내는데 필요한 것으로 예상된다. 이러한 경향은 promoter assay, western blot, RT-PCR 에서도 같은 결과를 확인하였다.; Dopamine (DA) neurons represent one of the major neuronal subtypes in the CNS and are clinically relevant to Parkinson's disease which is characterized by specific and progressive degeneration of these neurons in the substantia nigra of the midbrain. Nurr1 is a steroid receptor type orphan nuclear receptor which has a crucial role in the development of midbrain dopamine (DA) neurons. Consistently, etopic expression of Nurr1 sufficiently drove acquisition of DA phenotypes in cultured neural precursor cells. However, the DA cells derived from Nurr1-transduced precursors were morphologically and functionally immature neurons. In our previous study, co-expression of the proneural basic helix- loop- helix (bHLH) factor Mash1 greatly contributed to neuronal differentiation of Nur1-induced DA phenotype cells, thereby resulting in an efficient generation of functional mature DA neurons in the cultures transduced with Nurr1+Mash1. However, with our surprise, another type of proneural bHLH Neurogenin (Ngn) nearly completely repressed Nurr1-induced DA phenotype expressions. This study aimed to identify critical domains responsible for the contrasting effects of the bHLH proteins. Functional analyses of mutant and chimeric proteins of Mash1 and Ngn2 reveal that Helix domains, especially helix 1, is critical for the distinct bHLH effects in Nurr1-induced DA neuron differentiation.