핵자기 공명법을 이용한 Bleomycin-A2의 금속 착물 구조 연구

Abstract

현재 항암제로 사용되고 있는 Bleomycin은 금속과 착물된 형태로 특정 암세포를 인식하고 DNA 염기 배열과 비공유 결합을 이룸으로서 염기 서열을 균열시켜 항암작용을 한다. 이러한 Metallo-bleomycin의 기능을 이해하기 위해서는 분자구조의 결정이 필수적이다. 본 연구에서는 Bleomycin-A2와 Ga이 결합된 Ga-Bleomycin의 구조 결정을 하였다. Ga과 Bleomycin(BLM)을 사용하여 Ga binding-BLM의 착물을 합성하고 정제하였으며, 1H-NMR, 13C-NMR, gradient-Correlation Spectroscopy(gCOSY), Total Correlation Spectroscopy (TOCSY), gradient-Heteronuclear multiple quantum coherence (gHMQC), gradient-Heteronuclear multiplebond coherence (gHMBC) 실험을 통하여 Bleomycin 및 Ga-Bleomycin의 NMR 시그널을 지정하였고, 최적 온도 조건 및 pH 의존 실험을 하였다. Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY) 스펙트럼에서 얻은 NOE 신호를 바탕으로 수소들 간의 거리정보를 얻었고 이를 바탕으로 distance geometry(DG)와 molecular dynamics(MD)를 수행하여 Ga-Bleomycin의 3차원 구조를 결정하였다. 얻어진 구조가 실험적 NOE를 만족하는가를 비교하기 위해서 2D NOESY 역 계산을 실행하였으며, 그 결과 계산된 스펙트럼과 실험 된 스펙트럼이 일치함을 확인하였다. 연구 결과 β-aminoalanine, β-hydroxyhistidine, imidazole, 그리고 pyrimidine 고리의 질소 주게 리간드가 금속 이온과 결합하여 착물을 형성하는 것으로 밝혀졌으며, Ga-Bleomycin의 액상구조 분석 결과, axial 위치에 aminoalanine의 NH2와 당의 C=O가 추가적으로 결합함으로써 총 6배위 화합물임을 알 수 있었다.; Metallo-bleomycins, an anticancer drug metal complex, recognize specific tumor cell, and noncovalently bind to DNA base pair to cleave sequence. Molecular structure determination is necessary in order to understand the function of metallo-bleomycin. The purpose of this study is determine the structure of gallium binding bleomycin (GaBLM). In study, I refined BLM-A2 from BLM mixture. And an anticancer drug metal complex, gallium-binding BLM-A2 was synthesized by using microtitration in order to understand the function of metal complexes. Also, I have established following method for the metal-complexes by means of mass spectroscopy. Complete NMR signal assignment was accomplished by 2D NMR techniques which are gCOSY, TOCSY, NOESY, gHMQC, gHMBC. Comparison of chemical shift after complexation and NOESY experiment with different mixing times provided a detail structural feature of metal binding sites. Structural features of the complex were obtained by NMR-based distance geometry. 2D NOESY back-calculation method was performed to compare the obtained DG structure with experimental NOEs. Results exhibit that nitrogens of NH of β-aminoalanine, β-hydroxyhistidine, imidazole, and pyrimidine ring, α-NH2 of β-aminoalanine, oxygen of α-D-Mannose are the metal binding sites.