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특정 암세포와 유전자의 고감도 형광 이미지 측정 기술 개발

Title
특정 암세포와 유전자의 고감도 형광 이미지 측정 기술 개발
Other Titles
Development of Highly Sensitive Fluorescence Imaging Technology for Specific Cancer Cells and Genes
Author
김성용
Alternative Author(s)
Kim, Sung-Yong
Advisor(s)
주재범
Issue Date
2007-02
Publisher
한양대학교
Degree
Master
Abstract
1. 공초점 레이저 형광 현미경 및 표면 증강 라만 분광법을 이 용한 암세포의 분자영상 측정 기술 개발 양자점(quantum dots)은 그동안 일반적으로 사용되어 왔던 유기 형광염료에 비하여 광학적 안정성이 매우 뛰어날 뿐만 아니라, 그 밝기가 10배 이상 강력하기 때문에 세포뿐만 아니라 작은 동물의 in-vivo 영상에도 많이 응용 되고 있다. 본 연구에서는 이러한 양자점과 공초점 레이저 형광 현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용하여 다양한 암세포의 고감도의 분자 영상을 획득하는 연구를 수행하였다. 그러나 양자점은 그 중심이 되는 물질이 카드뮴/셀레나이드(Cd/Se)라는 중금속이기 때문에 독성에 관한 원천적인 한계성을 지니고 있으며, 이를 해결하고자 고분자 코팅 등의 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 양자점의 독성이 가지는 한계점을 인체에 무해하면서 고감도의 영상을 얻을 수 있는 기능성 나노프로브와 표면 증강 라만 산란 (Surface-enhanced Raman scattering-SERS) 기법을 이용하여 고해상도의 암세포 분자영상을 얻고자 하였다. 이에 따라 본 연구에서는 양자점 형광 영상을 이용하여 정상세포와 암세포를 구분하는 고감도 형광 영상을 얻었다. 본 연구에서는 또한 인체에 무해하며 선택적 표식이 가능한 기능성 금-은 나노입자를 제조하고 이를 이용하여 정상세포와 암세포를 구분하는 고감도 SERS 영상을 얻어 양자점을 이용한 고감도의 형광 이미지와 비교 분석함으로써 기능성 SERS 프루브의 바이오마커 검출 가능성을 연구하였다. 2. PDMS 마이크로-플루이딕 센서와 Molecular Beacon을 이 용한 고속 DNA 결합 측정 기술에 관한 연구 DNA hybridization 반응은 유전자 질병 및 유전자 발현 프로파일링에 있어 매우 중요한 검출 방법이다. 본 연구에서는 PDMS 마이크로-플루이딕 칩과 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Quenching 효과를 응용하여 DNA hybridization 반응을 매우 빠르면서도 실시간으로 모니터링 할 수 있는 바이오센서를 디자인 하였다. 본 연구의 특징은 부분은 머리띠 모양의 DNA 프로브(Molecular Beacon Probe : MB 프로브)를 디자인하여 DNA의 한쪽 끝에는 유기 형광염료(FAM)를 다른 한쪽 끝에는 quencher(Dabcyl)를 붙여 타겟 DNA를 검출하였으며, 또한 칩 내에서의 믹싱 효과를 극대화시키기 위해 악어 이빨 모양의 채널을 디자인하여 만든 PDMS 칩을 사용한 것이다. 실험은 마이크로 실린지 펌프를 이용하여 MB 프로브 DNA와 타겟 DNA를 칩 안으로 주사하였으며, 악어 이빨 모양의 채널을 이용하여 효율적인 프로브-타겟 DNA의 혼합을 수행하였다. 서로 상보적으로 결합 할 수 있게 설계된 염기서열을 가지는 두 DNA는 서로 결합하게 되는데, 이 과정에서 MB 프로브 DNA는 머리띠 모양에서 일자 모양으로 펴지게 돼 이로 quenching 되어 있던 염료의 형광시그널이 DNA hybridization에 의해 회복된다. 본 연구에서는 CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope)를 이용하여 칩 내의 위치에 따른 두 DNA의 결합 정도에 따른 형광세기를 실시간으로 모니터링 하였으며, 이로부터 이 마이크로-플루이딕 형광 센서가 초고속 DNA hybridization 바이오센서로 이용될 수 있는 가능성을 연구하였다.; 1. Biological Imaging of Cancer Cells Using Confocal Fluorescence & Surface Enhanced Raman Microscopy Quantum dots (QDs) are tiny-emitting crystals on the nanometer scale. They are emerging as one of the most effective fluorescent labels or a cellular imaging. IgG molecules conjugated to QDs show excellent binding capacity to specific antibodies of a cancer marker in a cell. The cellular fluorescence images and relative intensities are detected using a confocal laser scanning microscope. However it's toxicity problem should be solved for its biomedical applications because QDs are composed of toxic heavy metals. In order to solve this problem, non-toxic silver-coated gold nano-probes were fabricated. In this work, Raman dye-labeled metal nano-probes were prepared and then it was conjugated with immunoglobulin G (IgG) to effectively label the cancer marker expressed cancer cells. The localization and composition of the markers in the cells were identified using confocal fluorescence & surface enhanced Raman microscopy. In this work, it will be shown that QD-based probes are very effective for the cancer cell imaging compared with conventional organic dyes. In addition the highly sensitive detection technique of cellular protein using metal nano-probes and confocal SERS microscopy will be introduced. 2. Rapid DNA hybridization analysis using PDMS microfluidic sensor and molecular beacon Recently, we reported a new analytical method of DNA hybridization involving a PDMS microfluidic sensor using fluorescence energy transfer (FRET). This method overcomes many of the drawbacks of microarray chips, such as long hybridization times and inconvenient immobilization procedures. However, there are some limitations in its application to real DNA samples because the target DNA must be labelled with a suitable fluorescent dye. Toresolve this problem, a new DNA microfluidic sensor using a molecular beacon was developed in this study. In the molecular beacon, a fluorescent moiety is attached to the end of one arm and a non-fluorescent quencher is attached to the end of the other arm. By monitoring the change in the restored fluorescence intensity along the channel length, it is possible to rapidly detect the hybridization of the molecular beacon to the target DNA. In this case, the target DNA need not be labelled. Our experimental results demonstrate that this microfluidic sensor using a molecular beacon is a promising diagnostic tool that can be applied to high-throughput bioanalyses.
URI
https://repository.hanyang.ac.kr/handle/20.500.11754/150293http://hanyang.dcollection.net/common/orgView/200000406635
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