마이크로 전자빔을 이용한 주변효과 관찰을 위한 조건설정에 관한 연구

Abstract

마이크로 빔은 표적세포에서의 직접영향과 주변효과의 기전연구를 위한 주요한 수단이 된다. 원자력의학원에서 보유한 마이크로 전자빔 장치를 세포실험에 활용하고자 세포실험의 조건을 설정하고 전자빔 조사 프로토콜을 개발하였으며 이를 통해 전자빔의 단일세포 조사에 따른 주변효과를 평가하였다. 저에너지 전자빔 실험을 위해 특별히 고안된 마일러 용기에서 NCI-H460 세포에 대하여 세포 생존에 영향을 미칠 수 있는 배양시간, 핵염색을 위한 Hoechst 33258의 농도, 스캔동안의 자외선 노출, 생존한 콜로니와 부전 클론(abortive clone)의 판정기준 등의 인자를 분석하였다. 주변효과 관찰을 위해 마일라 용기의 중심을 포함하는 약 6.0×5.4mm2 면적의 120개 영상에 대하여 연속적인 촬영이 가능하도록 하였고, 특히 원점교정을 통해 조사 전 표적세포의 위치좌표를 콜로니분석 시에도 추적할 수 있도록 빔조사 프로토콜을 개발하였다. 설정된 세포실험 조건과 세포조사 프로토콜을 이용하여 30keV의 마이크로 전자빔으로 한 개의 NCI-H460세포를 2Gy 조사한 후 주변효과의 정도를 시험적으로 평가한 결과, 표적세포에서 방출되는 신호로 인한 주변효과로 시험세포군의 생존율이 10% 이상 감소하였다. 또한 주변효과에 의한 세포의 손상이 관심영역에 전체적으로 발생하는 것으로부터 단일세포 조사에 의한 주변세포의 손상확률은 표적세포와 손상된 세포 사이의 거리에 무관한 것으로 나타났다.; Microbeams represent a uniquely powerful techniques to assess the direct cellular responses from the target cells and bystander responses. Cell experimental conditions obtained with the electron microbeam cell irradiation system in KIRAMS were established and cell irradiation protocol was developed, which aided in evaluation of bystander responses by a single cell irradiation. In the specially constructed dishes based on mylar matrix devised for microbeam irradiation experiments at low energy electrons, potential influencial factors which could influence survival measurements such as incubation time, dye concentration of Hoechst 33258, UV-radiation exposure time during the scan, and the criterion used to distinguish between surviving colonies and abortive clones were analyzed. Continuous image acquisition algorithm of 120 frames was programmed to observe bystander responses, which covers approximately 6.0 × 5.4 mm2 area including the center of mylar plates. Beam irradiation protocol, especially the origin calibration in it, was developed to track positions between a single cell position before irradiation and a position after colony forming assay all the time. With the cell experimental conditions and a irradiation protocol, single cells irradiation experiments were performed to test bystander effect by electron beams with 2 Gy at 30 keV. Due to the signaling from the irradiated cell to unirradiated neighboring cells, more than 10% survival reduction was evaluated. Moreover, damaged cells caused by bystander effect were distributed almost all the area in the region of interest, which proves there is no distinct link between the risk probability to be damaged by a single cell irradiation and the distances from the irradiated single cell.