대두 단백 가수 분해물로부터 생리활성 탐색 및 항산화 펩타이드의 분리

Abstract

purified peptide)를 얻을 수 있었다. H-II의 specific activity는 108.13 %/㎍이였으며, 이는 SP의 specific acitivity와 비교시에 약 68배의 항산화활성에 해당하는 것이다. 정제 단계의 아미노산 조성을 탐색한 결과, SP-Ⅳ에서는 Asp/Asn과 Glu/Gln, Gly의 조성이 높게 나타났으며 G-Ⅳ에서 산성 및 친수성 아미노산인 Asp/Asn과 Glu/Gln의 함량이 감소된 반면, Gly의 함량은 다소 증가하였으며 소수성 아미노산인 Phe의 함량이 급격히 증가하여 주성분을 이루었다. 이러한 경향은 단일피크(PP)에서도 비슷한 양상으로 나타났다. 따라서 본 시료가 나타내는 항산화활성이 정제단계 시료의 주성분인 Phe와 관련성을 가지며, 이러한 관계는 Phe가 가지는 소수적 특성과 도 연관될 수 있다고 예측되었다. 따라서 본 연구 결과 대두 펩타이드는 항고혈압 활성, 항비만 활성, 항산화 활성 등 다양한 생리활성을 지닌 신소재임을 알 수 있었고, 항산화 활성을 보이는 펩타이드를 함유하고 있어 식품에서의 다양한 활용과 함께 항산화 관련 건강기능성 물질의 개발을 위한 신소재로서의 활용 가능성이 높을 것이라 생각된다.; This study was performed (1) to investigate various biological activities and (2) to purify the antioxidant peptide using various column chromatographic methods, and (3) to investigate the amino acid composition of antioxidant peptide from soybean peptide (SP). To examine various biological activities of SP, antihypertension, antiobesity, and antioxidant activity were determined in this study. Specific activities of ACE and adipogenic inhibitory were 4.99 %/㎍ and 0.52 %/㎍. Antioxidant specific activity of super oxide dismutase like specific activity was 0.02 %/㎍. Antioxidant activity of SP on the linoleic acid emulsion system was evaluated by the thiobarbituric acid and ferric thiocyanate method. Specific activities of TBA and ferric thiocyanate method were respectively 1.60 %/㎍ and 0.81 %/㎍. From these results, it was found that SP was a functional material having various biological activities. Among this activities, antioxidant activity was chosen, and then antioxidant activity was isolated from SP. Antioxidant activity peptides were prepared from SP using ultrafiltration, FPLC and HPLC, and their biological activities of antioxidant peptides were measured by TBA method and ferric thiocyanate method. Specific activities by TBA and ferric thiocyanate method were 6.34 %/㎍ and 5.50 %/㎍. Yield of the fraction (less than 3 kDa) through UF was 82.2%. TBA method was more higher activity than ferric thiocyanate method. So TBA method was chosen, and then antioxidant peptide was isolated from SP. The eluate from gel filtration chromatography (Superdex Peptide 10/300 GL column) was divided into four major fractions. Among them, the fraction G-Ⅳ had high the antioxidant activity (specific activity = 74.69 %/㎍). Fraction G-Ⅳ was further separated by RP-HPLC (reverse phase preparative-high performance liquid chromatography) with a linear gradient form 0% to 100% acetonitrile containing 0.1% TFA at a flow rate of 1 mL/min and fractionated into two fractions. The highest the antioxidant activity was in fraction H-II (specific activity = 108.13 %/㎍). To obtain a single compound, this fraction was further rechromatographed by RP-HPLC. Finally, we isolated a single antioxidant peptide (PP) from SP. The antioxidant peptide was purified 67.6-fold from SP using a four-step purification procedure. Amino acid composition of both G-IV and PP was mainly consisted of Phe, which was one of the representative hydrophobic amino acids. Based on our results, we suggest that Phe with hydrophobic property present in peptide contributed greatly for observed antioxidant activities. This results demonstrates that the antioxidant peptide from SP may be useful as a functional food ingredient with antioxidant activity. The further studies of animal experiments or clinical trials need to be performed.; 본 연구에서는 우수한 생리활성 펩타이드의 신소재를 개발하기 위하여 대두 펩타이드(SP)를 제조 한 후 다양한 생리 활성을 확인하였고, 항산화 펩타이드를 분리 및 정제 한 후 구성아미노산의 조성을 분석하였다. SP의 다양한 생리활성을 조사하기위하여 항고혈압 활성 및 항비만 활성, 항산화 활성을 측정하였다. 항고혈압 활성은 ACE(angiotensin I converting enzyme) 저해 활성을 통하여 측정하였고, 항비만 활성은 oil red o stain을 이용하여 지방 세포 분화 억제 활성을 측정하였으며, 항산화 활성은 SOD(super oxide dismutase) 유사활성과 유지산패에 대한 억제능을 측정하는 TBA(thiobarbituric acid)법과 ferric thiocyanate법으로 측정하였다. 그 결과, 항고혈압 및 지방 세포 분화 억제활성은 각각 4.99 %/㎍와 0.52 %/㎍의 specific activity를 나타내었으며 SOD 유사활성은 0.02 %/㎍, TBA법에서는 1.60 %/㎍, ferric thiocyanate법에서는 0.81 %/㎍의 specific activity를 나타내었다. 다양한 생리활성 중 항산화 활성을 선택하여 ultrafiltration(UF), Fast performance liquid chromatography(FPLC), Reverse-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC)를 이용하여 항산화 활성 펩타이드를 분리 및 정제하였으며 UF에 의해 분자량 30 kDa 이상, 10-30 kDa, 3-10 kDa, 3 kDa 이하의 4개의 획분으로 분리하여 항산화 활성을 측정한 결과, 3 kDa 이하(SP-Ⅳ)에서의 specific activity는 6.34 %/㎍로 가장 높은 활성을 나타내었으며 수율 또한 82.2%로 가장 높았다. UF에서 높은 활성을 나타낸 3 kDa 이하 물질을 Superdex Peptide 10/300 GL column(10×300 mm)로 gel filtration chromatography를 수행한 결과 4개의 fraction을 얻었다. 이 중 활성이 가장 높은 G-IV(specific activity = 74.69 %/㎍)를 농축하여 μBondapak™ C18 column (4.6×300 mm)을 이용하여 RP-HPLC를 수행한 결과, 2개의 fraction을 얻었으며 이중 높은 활성을 나타낸 H-II를 수득 후 농축하여 rechromatography하여 단일 peak(PP