대두단백 가수분해물(SPIH)로부터 ACE 저해활성 펩타이드의 분리 및 특성분석

Abstract

본 연구는 우수한 생리활성을 보이는 대두단백 가수분해물의 기능성 식품 소재화를 위한 기초연구로써 4가지 종류의 효소들에 의해서 생성된 대두 가수분해물의 가수분해도에 따른 ACE저해 활성 및 항산화 활성을 조사하고, ACE 저해활성이 우수한 가수분해물 제조조건(효소종류, 가수분해 시간, 가수분해도 등)을 결정하였다. ACE 저해활성을 보이는 대두단백 가수분해물(SPIH)로부터 한외 여과법 및 다양한 chromatography법을 이용하여 ACE 저해활성 펩타이드를 분리 정제하고, 대두가수분해물의 pH와 온도에 따른 ACE 저해활성 변화를 조사하였다. 기질로 사용한 분리대두단백질(SPI; soy protein isolate)은 증류수를 이용하여 10%(w/v) 농도로 제조하고 기질용액 단백질 농도의 0.5%에 해당하는 각각의 효소(Flavourzyme, Protamax, Bromelain, Papain)를 첨가하여 50℃에서 24시간 동안 가수분해를 진행하면서 시료를 취해 가수분해도를 측정하였다. 효소종류에 따른 가수분해 경향은 미생물 유래 protease complex인 Flavourzyme과 Protamax를 사용한 경우의 가수분해능이 다른 두 종류의 식물성 protease(Bromelain, Papain)에 비해 우수한 것을 알 수 있었다. 효소종류별 및 가수분해도에 따른 ACE 저해활성은 Protamax와 Papain을 사용하여 얻은 가수분해물에서 각각 52.25%(DH 18%)와 63.03%(DH 12%)의 우수한 활성을 나타냈으며, 가수분해도의 증가에 따라 ACE 저해활성도 증가함을 알 수 있었다. 따라서 우수한 ACE 저해활성을 보인 Potamax 0.5%를 이용하여 가수분해도를 18%가 되도록 제조한 가수분해물(SPIH)을 이용하여 이 후 ACE 저해활성 펩타이드의 분리 정제를 진행하였다. SPIH는 84.82%의 높은 단백질 함량을 보였으며, 그 외 회분 5.07% 및 지방 0.12%를 함유하였다. 분자량 분포는 10 kDa 이상이 전체의 76.44%, 3-10 kDa과 3 kDa 이하가 각각 16.82%와 17.04%로 나타났으며, 평균 분자량은 5 kDa으로 나타났다. SPIH의 항고혈압(ACE 저해활성) 활성은 52.25%였고, 항산화 활성을 위해 분석한 TBA(thiobarbituric acid), ferric thiocyanate 및 SOD 유사활성은 각각 75.34, 56.88, 및 47.56%으로 나타났다. 이상의 결과에서처럼 다양한 생리활성을 갖는 SPIH의 기능성 신소재화 가능성을 확인하였다. 따라서 다양한 생리활성을 갖는 SPIH로부터 ultrafiltration(UF), gel filtration chromatography, 및 HPLC를 이용하여 ACE 저해 펩타이드를 분리 정제 하였다. UF에 의해 분자량(10 Da 이상, 3-10 kDa, 3 kDa 이하)별로 분리하여 활성을 측정한 결과, 0.47%/ug protein의 높은 활성을 보인 3 kDa 이하의 시료를 취해 이 후 분리과정을 진행하였다. 3 kDa 이하 시료를 Superdex Peptide 10/300 GL column(10×300 mm)에 적용하여 6개의 fraction을 얻었다. 이 중 활성이 가장 높은 G1(specific activity = 0.76%/ug protein)을 농축하여 re-chromatography를 수행하여 4개의 fraction을 얻었다. 이 중 활성이 가장 높은 RG4(specific activity = 3.65%/ug protein)을 μBondapak™ C18 column(4.6×300 mm)에 적용한 결과, 3개의 peak 중 P3가 24.95%/ug protein의 높은 활성을 보여 SPIH에 비해 99.82배 정제되었음을 알 수 있었다. 대두단백 가수분해물(SPIH)의 pH와 열처리에 따른 ACE 저해활성 변화는 SPIH를 한외 여과하여 얻은 3 kDa 이하 시료를 이용하여 조사하였다. pH(2, 3, 7, 10, 12)에 따른 변성은 ACE 저해활성을 유의적으로 향상시키는 결과를 보였으며 pH 7에서 specific activity가 1.31%/ug protein로 가장 높은 ACE저해 활성을 보였다. ACE 저해활성은 산성조건에서 중성으로 가면서 증가하다가 알칼리화되면서 다시 감소하는 경향을 보였으나 미변성 시료에 비해 유의적으로 높은 활성을 보였다(p<0.05). 가장 높은 ACE저해 활성을 가진 pH 7.0 용액을 이용하여 가열온도(30, 50, 70, 100℃)에 따른 변성을 유도한 결과, 70℃에서 가열한 경우 0.55%/ug protein의 다소 높은 ACE저해 활성을 보였으나 미변성 시료와 비교 시 열처리에 따른 활성변화는 유의적으로 나타나지 않았다(p<0.05). 이상과 같은 연구 결과, Protamax 0.5%를 이용하여 가수분해도 18%가 되도록 제조한 대두단백 가수분해물(SPIH)은 항고혈압 및 항산화 활성 등 다양한 생리활성을 보였다. SPIH로부터 한외 여과법 및 다양한 chromatography법을 이용하여 ACE 저해 펩타이드를 분리 정제함으로써 99.82배가 정제된 활성분획을 얻을 수 있었다. 또한 SPIH로부터 얻은 분자량 3 kDa 이하 시료의 pH와 온도에 따른 ACE 저해활성 변화를 조사한 결과 변성에 따른 활성저하는 나타나지 않았다. 따라서 본 연구에서 사용한 SPIH와 이의 활성분획들은 혈압강하 기능을 갖는 대두단백 가수분해물의 생리활성 증대 및 안정적인 가공적성을 보임으로써 기능성 식품소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.; This study was performed in order (1) to compare the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activities of soy protein isolate hydrolysates obtained by various proteases, (2) to isolate and purify the ACE inhibitory peptide from soy protein isolate hydrolysate (SPIH) using various column chromatographic methods, and (3) to investigate the effect of pH and heating temperature on the ACE inhibitory activity. For the preparation of soy protein isolate hydrolysates, soy protein isolate (10%, w/v) was incubated with four different proteases (0.5% of protein content) for 24hr at 50°C. The degree of hydrolysis (DH) and ACE inhibitory activities of the hydrolysates were investigated and compared. ACE inhibitory activity increased as the DH increased. The hydrolysate (SPIH), which was produced by Protamax and was DH of 18%, was showed the high ACE inhibitory activity and was used for the further isolation and purification of ACE inhibitory peptide. SPIH was composed of crude protein of 84.82%, fat of 0.12%, ash of 5.07% and its average molecular weight was 5 kDa. Antioxidant and antihypertensive activities of SPIH were examined. Antioxidant activity of SPIH was evaluated in terms of TBA, ferric thiocyanate, and SOD-like activity. ACE inhibitory activity and antioxidant activity expressed as TBA, ferric thiocyanate, and SOD-like activity were 52.25%, 75.34%, 56.88%, and 47.56%, respectively. ACE inhibitory peptides were isolated from SPIH (specific activity = 0.25%/ug protein) using ultrafiltration, gel filtration chromatography, and HPLC. The ACE inhibitory activity (specific activity) and yield of the fraction (less than 3 kDa) through UF were 0.47%/ug protein and 9.92%, respectively. The fraction was subjected to consecutive chromatographic separations. The eluate from gel filtration chromatography (Superdex Peptide 10/300 GL column) was divided into six major fractions. Among them, the fraction G1 had the highest ACE inhibitory activity (specific activity = 0.76%/ug protein). It was lyophilized and subjected to gel filtration re-chromatography. Among four fractions, fraction RG4 (specific activity = 3.65%/ug protein) was further separated by RP-HPLC (reverse phase preparative-high performance liquid chromatography) with a linear gradient form 0% to 100% acetonitrile containing 0.1% TFA at a flow rate of 1 mL/min and fractionated into three fractions. The highest the ACE inhibitory activity was in fraction P3 (24.95%/ug protein). The ACE inhibitory peptide was purified 99.82-fold from SPIH using a five-step purification procedure. The effect of pH and heating temperature on ACE inhibitory activity of the UF fraction (less than 3 kDa) of SPIH was investigated for the evaluation of potential for industrial application. ACE inhibitory activity increased as pH increased from 2 to 7 but decreased as pH increased after 7. ACE inhibitory activity increased by pH but was not significantly affected by heating (p<0.05). These results demonstrated that the ACE inhibitory peptide from SPIH may be useful as a functional food ingredient with antihypertensive activity. The further studies of the more purification of active peptide and animal experiments or clinical trials need to be performed.