Effects of vitamin C on paraquat-induced dopamine neurotoxicity in C57BL/6 mice

Abstract

도파민은 뇌 전체에 분포되어 있는 신경전달물질 중의 하나이다. 뇌 흑질치밀부(substantia nigra pars compacta, SNpc)에 존재하는 도파민 신경세포의 사멸과 선조체(striatum)의 도파민 결핍은 비정상적 운동 장애를 초래하여 파킨슨 질병의 원인이 된다. 제초제의 일종인 paraquat는 인체 노출 시 체내에서 활성산소종의 형성 및 선택적인 도파민 신경세포의 독성을 유도한다. 일부에서는 활성산소종 형성을 억제하는 것이 paraquat 중독 치료의 근간으로 여겨져, paraquat 중독 환자에서 비타민 C는 항산화 영양소로 사용되기도 하였다. 또한, 비타민 C는 신경세포에 작용하는 호르몬 합성에 관여하는 것으로도 알려져 있다. 따라서, 본 연구에서는 비타민 C가 파킨슨 질병과 관련된 도파민 신경독성 유발에 미치는 영향에 관하여 조사하였다. 본 연구는 생쥐를 이용하여 paraquat에 의한 도파민 신경독성을 유발하여 뇌에서 이들의 부위별 차이를 비교하였고, 용량에 따른 비타민 C의 영향을 조사하였다는 것에 그 의의를 두었다. 7주령 수컷 C57BL/6 생쥐를 일주일 동안 적응시킨 후, 생리식염수(대조군)와 4, 40, 400 mg/체중 kg(LC, IC, HC군) 용량의 비타민 C를 4주 동안 복강주사하였고, 동시에 각각 동물의 절반은 paraquat(10 mg/체중 kg, 복강주사)를 3주 동안 주 2회 투여하여 총 6회 투여하였다(PQ, LCPQ, ICPQ, HCPQ군). 비타민 C와 paraquat를 투여하는 기간 동안, 행동학적 변화를 관찰하기 위하여 주 2회 rota-rod 시험을 실시하였다. 각 군에서 생쥐 중 6마리를 이용하여 선조체와 흑질에서 왼쪽 부위는 도파민과 도파민 대사물질들을 측정하기 위한 HPLC 분석을 하였고, 오른쪽 부위는 산화형과 환원형 glutathione 분석을 하였다. 각 군의 나머지 5마리를 이용하여 선조체와 중뇌에서 tyrosine hydroxylase (TH) 면역염색을 하였고, Nurr1 mRNA 발현을 관찰하기 위하여 in situ hybridization을 실시하였다. 본 연구의 결과는 다음과 같다. 1. Paraquat는 뇌의 흑질 치밀부의 면역반응성 신경세포와 신경섬유를 정상군의 약 40%까지 감소시켰다. 400mg/kg 용량의 비타민 C를 투여한 HC군에서 선조체의 4개 하위영역(부리쪽과 꼬리쪽 선조체에서 각각 등쪽과 배쪽)의 TH 면역반응성 신경세포와 신경섬유는 대조군에 비하여 감소하는 결과를 보였다. 2. 선조체의 도파민 수준은 paraquat에 의하여 낮아졌다. 흑질의 TH 면역반응성 신경세포와 도파민 손실과 함께 선조체의 도파민 수준은 감소하였다. 이러한 결과는 선조체 4개의 하위영역에서 차이를 보였다. 흑질부의 도파민은 부리쪽 선조체의 등쪽(the dorsal subregion of the rostral striatum) > 꼬리쪽 선조체의 등쪽(the dorsal subregion of the caudal striatum) > 부리쪽 선조체의 배쪽(the ventral subregion of the rostral striatum) > 꼬리쪽 선조체의 배쪽(the ventral subregion of the caudal striatum)의 순서로 강한 양의 상관관계를 보였다. 본 연구에서 이용된 4 mg/kg 용량의 비타민 C는 선조체 4개의 하위영역에서 paraquat에 의한 도파민 감소를 저해하였으나, 흑질부에서는 이러한 비타민 C의 영향이 나타나지 않았다. 40 mg/kg 용량의 비타민 C는 꼬리쪽 선조체의 등쪽을 제외한 선조체와 흑질부에서 paraquat에 의한 도파민 손실을 막았다. 이러한 결과로 볼 때, 4 와 40 mg/kg 용량의 비타민 C는 paraquat에 의한 선조체의 도파민 감소를 부분적으로 보호하는 효과를 보인다고 할 수 있겠다. 3. 도파민에 대한 도파민 대사물질의 비로 나타낸 MAO (monoamine oxidase)와 COMT (catechol-O-methyltransferase) 활성도를 보면, 부리쪽 선조체에서 paraquat에 의한 MAO 활성도의 감소를 보였으며, 세 가지 용량의 비타민 C의 영향은 보이지 않았다. 흑질부와 부리쪽 선조체에서는 paraquat에 의한 COMT 활성도 증가를 보였으나, 흑질부과 선조체 사이의 상관관계는 보이지 않았다. 또한, 꼬리쪽 선조체의 MAO와 COMT 활성도는 흑질 또는 다른 선조체 하위영역 사이에서 부위에 따른 어떠한 상관관계도 보이지 않았다. 4. 부리쪽 선조체에서 paraquat는 환원형 glutathione 수준을 감소시켰고, 부리쪽 선조체 중에서도 등쪽부위의 환원형 glutathione 수준은 도파민 수준과 양의 상관관계를 보였다. 즉, 부리쪽 선조체에서 paraquat에 의해 감소된 도파민 수준이 환원형 glutathione의 감소에 직접적인 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 그러나, 꼬리쪽 선조체에서는 도파민과 환원형 glutathione 사이에서 상관관계를 보이지 않았다. 산화형 glutathione은 흑질에서 paraquat에 의해 감소되었고, 이는 부리쪽 선조체에서 산화형 glutathione과 음의 상관관계를 보이므로 부리쪽 선조체에서 산화형 glutathione의 증가에 직접적으로 관여한 것으로 생각된다. 5. Nurr1 mRNA 발현은 대조군의 중뇌 흑질에서 관찰되었으며, paraquat와 비타민 C를 투여한 군에서도 발견되었다. 그러나, HCPQ군에서 Nurr1 mRNA 발현은 나타나지 않았다. 이러한 결과는 TH 면역반응성 신경세포와 신경섬유의 증가 또는 감소 패턴과 유사한 결과를 보인다. 위의 결과를 종합하여 보면 다음과 같다. 이 연구를 통하여 paraquat를 이용한 신경독성 유발이 가능함을 재확인하였고, 이러한 paraquat에 의한 신경독성이 4와 40 mg/kg 용량의 비타민 C에 의해 부분적으로 감소되는 결과를 관찰할 수 있었다. 흥미롭게도, 이 연구의 결과는 paraquat에 의해 유발된 도파민 감소가 뇌의 부위에 따라 그 민감도가 다르다는 것을 제시하고 있으며 특히 부리쪽 선조체에서 가장 민감하다는 것을 보여주고 있다. 또한 이 부위에서 4와 40 mg/kg 용량의 비타민 C는 도파민 손실에 있어서 효과적인 보호작용이 가능함을 제시한다. 따라서, 본 연구의 결과는 파킨슨 질병의 발병과 관련된 도파민 신경독성에 대해 부분적으로 비타민 C의 보호작용이 있음을 제시하고 있으며, 이는 파킨슨 질병 예방에서 비타민 C의 이용에 관한 기초자료가 될 것으로 생각된다.; Dopamine (DA) is a catechol neurotransmitter widely distributed throughtout the brain. Dopaminergic neurons are found in various regions of the brain, and nigrostriatal dopaminergic system is importantly involved in Parkinson’s disease (PD). The herbicide paraquat is a strong redox agent that participates in the formation of reactive oxygen species (ROS) and induces toxicity of the nigrostriatal dopaminergic system. Vitamin C is involved in the biosynthesis of catecholamines and may stabilize catecholamines from forming ROS. The aim of the present study is to investigate the effect of three doses of vitamin C on paraquat-induced dopamine neurotoxicity in mice. Male C57BL/6 mice (aged 7 weeks and 23-25 g) were divided into eight groups (n=11). Saline (control) and vitamin C (4, 40, and 400 mg/kg body weight, i.p.; LC, IC, and HC) treated daily for 4 weeks from 3 d before first paraquat injection. Half of the mice were injected with paraquat (10 mg/kg body weight, i.p.) twice per week for 3 consecutive weeks (PQ, LCPQ, ICPQ, and HCPQ). In six of the eleven mice, the left half of the brain tissues was used for determination of DA by HPLC and the right half was used for glutathione assay. And, five mice were used for tyrosine hydroxylase (TH) immunostaning and in situ hybridization. We measured changes in rota-rod test, neurotransmitter levels (DA and its metabolites), TH immunoreactivity (TH-IR), and Nurr1 mRNA expression in the striatum and the substantia nigra (SN) of C57BL/6 male mice. Also, we determined whether the extent of paraquat-induced neruodegeneration was correlated to the degree of oxidation of glutathione as an indicator of oxidative damage scavenger. The results were as follows; 1. In the SN pars campacta (SNpc), the densities of TH-IR neurons showed approximately 40 % decrease by paraquat compare to the control. The densities of TH-IR fibers in the dorsal subregion of the rostral striatum and the ventral subregion of the caudal striatum were also decreased by 400 mg/kg dose of vitamin C injection in intact mice (HC group). 2. In the striatum, DA levels were decreased by paraquat. The DA levels in the striatum were decreased with loss of TH-IR neurons in SN. The DA levels of the SN have strong positive relationships to those of the striatum in order of the dorsal subregion of the rostral striatum > the dorsal subregion of the caudal striatum > the ventral subregion of the rostral striatum. The 4 mg/kg dose of vitamin C used in this study prevented the paraquat-induced DA loss in four subregions of the striatum, but not in the SN. The 40 mg/kg dose of vitamin C prevented the decrease of paraquat-induced DA levels in the SN as well as in the striatum except for the dorsal subregion of the caudal striatum. These results revealed that 4 and 40 mg/kg doses of vitamin C could partially provide protective effects against paraquat-induced DA loss of the striatum. 3. The monoamine oxidase (MAO) activities were increased by paraquat in the rostral striatum. In the rostral striatum, three doses of vitamin C used in this study did not affect these MAO activities in the paraquat-injected mice. These MAO activities also showed the positive correlation between the dorsal subregions of the rostral and caudal striatum. The catechol-O-methyltransferase (COMT) activities were increased by paraquat in the SN and the rostral striatum. However, the COMT activities in the SN were not correlated with those in the striatum. Vitamin C inhibited the increase of COMT activities by paraquat in the rostral striatum. 4. The reduced glutathione (GSH) levels were decreased by paraquat in the rostral striatum. These decreases of GSH levels in the dorsal subregion of the rostral striatum were correlated with the decreases of DA levels. These findings showed that DA levels decreased by paraquat directly affected levels of GSH in the rostral striatum. However, in the caudal striatum, there was no correlation between GSH and DA levels. The oxidized glutathione (GSSG) levels showed the negative correlation between the SN and the ventral subregion of the rostral striatum, which was positively correlated with the dorsal subregion of the rostral striatum. The GSSG levels decreased by paraquat in the SN might induce increases of GSSG levels in the rostral striatum. The present study showed that the 4 mg/kg dose of vitamin C prevented the decreases of GSH levels induced by paraquat in the SN and the dorsal subregion of the rostral striatum, and the 40 mg/kg dose of vitamin C inhibited the decreases of GSH levels induced by paraquat in the rostral striatum. 5. Reductions of Nurr1 mRNA expression were observed by three doses of vitamin C as well as by paraquat. Furthermore, the 400 mg/kg dose of vitamin C injection with paraquat was not shown any Nurr1 mRNA expression. This result was similar to the increasing and/or decreasing patterns of TH-IR neurons and fibers in the SN. In conclusion, we confirmed that paraquat (10mg/kg b.w., i.p.) induced dopamine neurotoxicities in the present study. In particular, these neurotoxic effects of paraquat in mice could be reduced by 4 and 40 mg/kg doses of vitamin C. Interestingly enough, this study suggests that these effects of vitamin C on paraquat-induced dopamine neurotoxicities are sensitive in the rostral striatum, especially the dorsal subregion. Accordingly, these data suggest that vitamin C particularly protects against the development of PD. Therefore, these findings suggest that the 4 and 40 mg/kg doses of vitamin C may be beneficial in treating the early stage of PD. These data will also be used as preliminary data related to animal models of PD and effect of vitamin C in PD.