제대정맥혈로부터의 호산구의 분화에서 chemokine receptors의 발현 및 조절

Abstract

Chemokine receptor는 내피세포, 뉴런뿐만 아니라 광범위한 백혈구에서 발현하고 있으며 조혈과정을 비롯해 호산구와 비만세포의 탈과립이나 chemotaxis에 관여한다. 본 연구에서는 CC chemokine receptor 3 (CCR3)에 초점을 맞추었다. CCR3는 호산구 관련 특이적 표지자 이기 때문에 이것의 발현을 유도하는 과정에 대한 연구가 myeloid progenitors가 호산구 계통으로 운명이 결정지어 지는데 중요한 정보를 제공할 것으로 보인다. 본 연구에서는 제대혈로부터 호산구로의 분화 동안 Th1 chemokine receptors인 CCR2 및 CXCR3, Th2 chemokine receptors인 CCR3, CCR4, CCR8, 그리고 모든 세포에서 발현하는 CXCR4의 발현을 RT-PCR, 유세포분석(FACS), 그리고 화학주성(chemotaxis)법으로 조사한 결과 CCR3의 발현 정도 및 화학주성이 호산구로의 분화 정도와 병행하는 것을 알 수 있었다. 한편 최근에 적어도 4개의 exons으로 구성된 CCR3 유전자의 exon1 DNasel hypersensitive site 가 존재하며 호산구의 운명 결정에 중요하게 작용하는 전사인자인GATA-1이 결합한다는 보고가 있었다. 따라서 본 연구에서는 제대혈로부터 호산구로 분화 동안에 CCR3의 어느 발현 조절 부위에 GATA-1의 결합하는 지를 in vivo에서 알 수 있게 해주는 ChIP assay를 통해 조사하였다. 결과로서 기존에 알려진 exon1뿐만 아니라 exon1에 인접하는 intron1과 심지어는 protein-coding region에도 GATA-1이 결합하였고, 호산구 분화 정도에 비례하여 결합이 증가하였다. 또한 이에 일치하여 이 두 곳 모두에 potential GATA-1 binding sites가 존재한다는 것을 확인 하였다. 결론적으로 CCR3의 발현 조절부위에 GATA-1의 결합부위를 in vivo 상에서 최초로 밝혔다. 따라서 reporter assay나 point mutations를 통해 이들 GATA-1 결합부위에 의한 CCR3의 발현이 조절되는지에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.; Chemokine receptors are expressed on wide range of leukocytes including endothelial cells, neurons, and possibly other cell types where they are involved in signaling events that can lead to eosinophil and mast cell degranulation, chemotaxis, and hematopoiesis. This study focused on a CC chemokine receptor 3 (CCR3). Because CCR3 is known to be one of eosinophil-specific markers, the analysis of the molecular mechanism whereby CCR3 expression is regulated may give insight into the understanding of the commitment of myeloid progenitors to the eosinophil lineage. First, I examined the expression of a panel of chemokine receptors during cord blood-derived eosinophil differentiation; these included Th1 chemokine receptors for CCR2 and CXCR3, Th2 chemokine receptors for CCR3, CCR4 and CCR8, and ubiquitous chemokine receptor, CXCR4, using RT-PCR, FACS and chemotaxis analysis. As a result, the expression of only CCR3 among the others paralleled the extent of eosinophil differentiation, as evidence by MBP expression, another eosinophil-specific marker. It was recently demonstrated that CCR3, which consists of at least 4 exons, has a DNase I-hypersensitivity sites and the binding sites within its exon1 for GATA-1 that is an important transcription factor for eosinophil-commitment and differentiation. Accordingly, I investigated which sequences in CCR3 gene are responsible for the GATA-1 binding during cord blood-derived eosinophil differentiation with a tool of chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which allowed to determine in vivo binding. My data showed that GATA-1 bound to intron1 immediately flanking exon1 and even protein-cording region (the last exon) as well as exon1 that is already known to be sites for GATA-1, and that the binding was increased as eosinophil differentiated. In agreement with this result, all these binding sites had the putative GATA-1 sites. In conclusion, this study is, to my knowledge, the first report that GATA-1 binding occurs in in vivo throughut CCR3 gene including exon1, intron1, and protein-coding region. Further study is necessary to see how these GATA-1 sites are involved in CCR3 expression at a molecular level during eosinophil differentiation using reporter assay and point mutations etc.