돼지 유행성 설사병 바이러스의 분자 생물학적 진단 방법 확립과 면역 방어 연구를 위한 IgA 항체 효소면역측정법 개발

Abstract

돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; TGEV), 돼지 로타 바이러스(procine group A rotavirus; Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), a member of the family Coronaviridae, has been caused a devastating enteric disease in Korea swine industry. Four major open reading frames (ORFs) have been identified in the 4 kilobases nearest to the 3′end of the genome. Three of them encode the distinctive coronavirus structural proteins N (nucleocapsid), sM (small membrane), and M (membrane). The fourth ORF, designated ORF3 and located upstream of the sM gene, encodes a product of unknown function which may be dispensable for virus replication in cell culture. Like the functions of structural proteins of other coronaviruses, spike (S) protein of PEDV is involved in binding to specific host cell receptor glycoprotein, inducing fusion of viral envelope with cell membrane, and inducing neutralizing antibody. Currently, several vaccines have been applied to some regions where they have a have a high burden of PED and in Korea, cell adapted PEDV DR13 has been used as useful vaccine. In this study, the spike (S) gene of the attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) DR13 was cloned and sequenced to further explore the functions of wild type PEDV and attenuated PEDV. It appears that attenuated PEDV DR13 is closely related to wild type PEDV CV 777. But prediction of N-glycosylation site using the ExPASy (Export Protein Analysis System) Proteomics Server of Swiss Institute of Bioinformatics(SIB) revealed that the changes was found at two site on amino acid sequence (from N to K at 378, from T to I at 1,260). Because of above, it is considered that attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) DR13 exhibited reduced pathogenicity in pigs. Virus detection is the best means of assessing the current epizootic situation in a swine herd. In order to evaluation of PEDV shedding patterns, an internal control was constructed and quantitative analysis of virus shedding after oral inoculation was established. A parent field PEDV and a cell culture adapted PEDV DR13 were inoculated orally to colostrums-deprived 1-day-old piglets, commercial 2-week-old pigs, and sows (1 ~5 ㎖ dose, 105.8-106.0 TCID50/0.1 ㎖). PEDV shedding was monitored every day and virus levels were measured using a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) method. In fecal samples from experimentally-inoculated pigs, the level of virus excreted peaked at 2 days after oral inoculation and gradually decreased thereafter. In addition, PEDV from field specimens was quantified using the same RT-PCR assay to determine shedding viral load. With PEDV, TGEV and procine GAR (porcine group A rotavirus) are major agents in viral enteric disease of piglets. As the clinical signs of these diseases are similar, including watery diarrhea, differential detection is required for etiologic diagnosis. In this study, it was established how to detect 3 viruses simultaneously. A total of 157 specimens (78 fecal and 79 intestinal samples) from piglets with acute gastroenteritis were tested for the presence of 3 viruses by multiplex RT-PCR. Coinfection with PEDV and porcine GAR were identified in 16 farms (43.2%). PEDV, porcine GAR, and TGEV infection were 26.3%, 13.2%, and 2.7% respectively. The relative sensitivity and specificity of multiplex RT-PCR were evaluated, with results suggesting that this assay is equal in quality to conventional single-agent RT-PCR assay (sensitivity:100%, 92.9%, 100% for TGEV, PEDV, GARs; PEDV)는 코로나 바이러스과에 속하며, 국내 양돈 산업에 큰 피해를 일으키는 원인체 중 하나이다. 돼지 유행성 설사병 바이러스의 게놈 RNA의 3’말단 부근에 당화 표면돌기 단백질을 코딩하는 스파이크(S) 유전자, 막 당단백질을 코딩하는 M 유전자, 뉴클레오캡시드를 코딩하는 N 유전자 등이 존재한다. 이 바이러스의 스파이크 단백질(S)은 숙주세포의 당 단백질 수용체와 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이는 세포막과 바이러스 외막의 융합을 야기하고 중화 항체의 생성을 야기한다. 현재 돼지 유행성 설사병 피해가 큰 나라들을 중심으로 백신을 개발하여 사용하고 있으며, 국내에서도 세포 순화 돼지 유행성 설사병 바이러스(DR13) 제제가 개발되어 사용되고 있다. 본 연구에서는 중화 항체 생성에 관여하는 순화 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 유전자를 클로닝하여 야생형 돼지 유행성 설사병 바이러스와 순화 돼지 유행성 설사병 바이러스의 염기서열과 아미노산서열을 비교하였다. 야생형 돼지 유행성 설사병 바이러스(CV 777)의 스파이크 유전자와 염기서열 및 추정 아미노산서열을 비교 분석하였 을 때 각각 96.5%, 95.7%의 상동성을 나타내어 비교적 높은 상동성을 나타내었다. 그러나 ExPASy (http://au.expasy.org/tools/)를 이용한 N당화 분석에서, 순화 돼지 유행성 설사병 바이러스는 2곳에서 변이가 있었다(아미노산 서열 378번, 아미노산 서열 1,260번). 이러한 변이로 세포 순화 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV DR13)가 병원성은 감소된 대신 면역성을 유발할 수 있는 능력을 유지하고 있는 것으로 판단된다. 돈 군에서 현재의 전염상황을 판단하는 가장 좋은 방법은 바이러스를 직접 검출하는 것이다. 돈 군에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 배출 양상을 측정하기 위하여 내부 대조액을 제조하여 경구 접종 후 바이러스 배출 정량 시험을 실시하였다. 초유를 수유 중인 1일령 자돈과 2주령 자돈 그리고 모돈에 야외 독성 돼지 유행성 설사병 바이러스와 세포 순화 돼지 유행성 설사병 바이러스를 105.8-106.0 TCID50/0.1 ㎖의 역가로 1~5 ㎖씩 경구 접종하였다. 접종 후 매일 관찰하였고 정량 RT-PCR 방법으로 바이러스를 정량하였다. 실험적으로 접종한 돈 군의 분변 검체에서 바이러스는 접종 후 2일째 최대량을 나타냈고, 그 후 점차 감소되었다. 자연 감염된 검체에서도 돼지 유행성 설사병 바이러스를 RT-PCR 방법으로 정량할 수 있었다.돼지 유행성 설사병 바이러스와 더불어 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; GAR)는 자돈에게 바이러스성 장 질환을 야기하는 중요한 원인체이다. 이들 질병의 임상적 증상은 매우 유사하여 감별하기 위해서는 각기 다른 검사법이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 이들 3개 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 다중 RT-PCR 방법을 확립하였다. 총 157개 자돈 검체를 확보하여 다중 RT-PCR을 수행하였다. 돼지 유행성 설사병 바이러스와 로타 바이러스에 동시에 감염된 검체는 43.2%였고, 돼지 유행성 설사병 바이러스, 로타 바이러스, 전염성 위장염 바이러스 개별 감염은 26.3%, 13.2%, 2.7%였다. 다중 RT-PCR의 감도 및 특이도를 일반 RT-PCR 방법과 비교한 결과, 감도는 전염성 위장염 바이러스 100%, 돼지 유행성 설사병 바이러스 92.9%, 로타 바이러스 100%였고, 특이도는 3개 바이러스에서 모두 100%였다. 백신 접종여부 및 질병관리 프로그램을 수행할 때 혈청학적 진단법이 쓰이고 있다. 현재 모돈 혈청에 존재하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체가는 주로 혈청 중화 방법을 이용하고 있는데 이 방법은 혈청내 IgG, IgM, IgA와 동시에 반응하기 때문에 자돈의 면역 방어능과 혈청 중화 항체가와는 많은 차이가 나타나고 있다. 글로불린 중에서 IgA가 돼지 코로나 바이러스에 있어 방어능에 가장 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 항 돼지 유행성 설사병 바이러스 IgA 양성 검체는 근육 면역군 자돈과 백신하지 않은 자돈보다 경구 면역군 자돈에서 많았다. 인위적으로 야외 돼지 유행성 설사병 바이 러스를 경구 접종한 모돈군에서 태어난 자돈의 생존률이 근육 면역 모돈군 보다 생존 능력이 높았다(87.5% 대 40%). 따라서 엘리자 방법을 이용한 IgA 항체 측정 방법을 확립하여 IgG, IgA, 혈청 중화 역가를 비교하였다. IgA 역가는 IgG, 혈청 중화 역가와 차이가 있었고 이는 혈청 중화 역가가 돼지 유행성 설사병 바이러스 감염에 대한 방어능을 알려 주는 지표가 되지 못 함을 나타내었다. 본 연구에서는 국내 양돈 산업에서 주요 전염성 장 질환의 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스에 기인한 질환에 대한 원인체를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 분자 생물학적 진단 방법을 확립하였고, 자돈의 바이러스에 대한 방어능에 있어 모돈 초유 내 IgA 항체의 역할을 규명하여 방어능을 정확하게 측정할 수 있는 면역학적 진단법을 확립 하였다.; specificity: 100% for all 3 viruses). Serodiagnostic tool is used to estimate the proportion of infected pigs as part of national and regional health monitoring schemes or for making decision about vaccination or disease control program. Currently, the SN test is the most common serological method in veterinary diagnostic laboratories for detecting PEDV antibodies. However, the SN test can be used to detect IgG, IgM, and IgA simultaneously. As a result, there are significantly different between immune protection and SN titer. Secretory IgA, the predominant Ig in milk of lactating sows, provide passive protection and IgA is more effective than IgG and IgM. Positive for anti-PEDV IgA were detected more frequently among oral-vaccinated pigs than IM-vaccinated or non-vaccinated pigs. The survival rates of piglets born from the oral group were significantly higher than those of the IM group after virulent virus challenge (87.5% vs 40%). In this study, IgA ELISA method for PEDV was established and compared with IgG and SN titer. Among the IgG, IgA, and SN titers evaluated, only the IgA titers were significantly different between the two groups. These results suggest that the SN titer is not a valid indicator of protection against PEDV infection.