Study on the DNA vaccine candidate encoding conserved gene of influenza virus

Abstract

인플루엔자바이러스는 주로 겨울철에 호흡기 증상을 유발시키는 RNA 바이러스로서 외부 항원 단백질의 빈번한 변이 때문에 DNA 백신 등 새로운 항원형의 바이러스에 대한 백신 개발에 관한 연구가 지속적으로 이뤄지고 있다. 이에 본 연구에서는 국내 인플루엔자바이러스 B형 분리주 (Influenza virus, B/Seoul/49/2004)의 유전자 중 virion 내에 많이 분포하고 conserved한 matrix (M1)와 nucleoprotein (NP)를 대상으로 DNA 백신 후보 물질을 확보하였다. 이를 위해 expression plasmid (pcDNA 3.1 V5/His TOPO plasmid)를 이용하여 클로닝을 실시하였고, PCR, 제한효소절단법 그리고 염기서열 분석법을 이용하여 M1과 NP 유전자에 대한 재조합 클론을 확인하였다. 이 후 in vitro상에서의 발현 여부를 조사하고자 293T 세포에 transfection 시킨 후 SDS-PAGE와 western blotting 방법에 의해 M1 및 NP 단백질에 고유한 밴드를 확인하였으며 또한 간접면역형광항체법 (Immunofluorscence Assay)에 의해서도 M1 및 NP 재조합 단백질이 발현됨을 확인하였다. 확인된 M1과 NP plasmid들은 BALB/c mice에 2주 간격으로 3회 접종되었고, 접종 전 그리고 후에 혈청을 확보하였다. 확보된 전후 혈청을 이용하여 ELISA를 수행한 결과, M1에 대한 anti-IgG는 약 2배 정도 상승했으며 NP에 대한 anti-IgG 값은 약 5배 정도 상승하였다. western blotting에서는 NP 단백질에 대한 밴드만이 발견되었으며 그 밴드들은 ELISA에서의 흡광도와 비례하여 나타났다. 본 연구를 통해 B형 인플루엔자바이러스의 M1과 NP 유전자가 in vitro 그리고 in vivo에서도 발현됨을 확인할 수 있었으며, 이는 아울러 DNA 백신 후보 물질로서의 가능성을 확인할 수 있었다.; As mainly circulating in winter seasons, and causing various respiratory symptoms, influenza virus is an RNA virus whose surface glycoproteins are rapidly changed. So many researches on influenza virus vaccine have been starting. One of the researches is DNA vaccine using major antigenic genes and expression plasmids. In this study, I have started to research with a Korean influenza B virus isolate (Influenza Virus B/Seoul/49/2004). The Matrix (M1) and Nucleoprotein (NP) genes, which are more conserved and abundant than other components in an influenza virion, were cloned into pcDNA 3.1TM V5/His plasmids, then the plasmids were administrated into BALB/c mice at 3 times with 2-weeks interval. In order to confirm whether the genes were exactly inserted into the plasmids or not, I analyzed them by polymerase chain reaction (PCR), restricted enzyme digestion and sequencing analysis. Thereafter, I detected that the plasmids were in vitro expressed in 293T cell through western blotting and immunofluorscence assay. I also injected the plasmids into BALB/c mice, and retro-orbitally bled them after the final administration. To examine humoral immunity, I performed western blot and ELISA with the pre- and the post-immunized mice sera. As a result of ELISA, IgG-levels against M1 and NP antigens were increased by around 2-fold and 5-fold, respectively. In western blotting with the immunized sera, I detected only NP-specific bands of which strength were corresponded with their absorbances from ELISA. Thus, I confirmed the expression of M1 and NP by in vivo and in vitro, therefore, it showed the possibility of a useful influenza virus DNA vaccine.