Luminex xMAP™을 이용한 남성 불임 진단 연구

Abstract

현재 우리나라에는 결혼한 부부 7쌍 중 1쌍이 불임으로 고통 받고 있다. 이중 33%는 남성 측 단독으로, 20%는 남성 여성 양쪽 모두 문제가 있는 경우이다. 과거 동서양을 막론하고 불임의 책임을 전적으로 여성에게 미루었으나 사실 남성에 의한 불임이 50% 이상을 차지하며 이는 전체 결혼한 남성의 5~15%에 해당한다. 남성 불임의 원인 중 가장 큰 비율을 차지하는 정자 형성 장애의 원인은 크게 선천적 이상과 후천적 이상으로 나눌 수 있고, 선천적 이상은 클라인펠터 증후군이 대표적이지만, Y 염색체 상의 미세 결실에 의해서도 기인한다고 알려져 있으며 남성 불임 환자 가운데 Y 염색체 미세결실이 관찰되는 환자의 빈도는 최저 1.0%에서 최고 55.5%까지 매우 다양하게 보고되었다. 여러 연구들을 토대로 한 통계에 의하면 12~13%의 무정자증 환자와 3.4%의 감정자증 환자들이 Y 염색체 미세결실을 포함하고 있다고 보고되었다. Y 염색체 상의 미세결실에 의한 불임의 경우 정자가 없는 것을 제외하고는 특이적인 증상이 없으므로 다른 원인에 의한 무정자증과 임상적으로 구분하기가 어렵다. 따라서 다른 원인의 무정자증과 구분하기 위한 진단 방법과 치료 방법의 개발이 요구된다. 유전체 이상으로 인한 남성 불임을 검사하기 위해 핵형분석(Karyotype)과 써던블럿(Southern hybridization), STS-PCR, DNA chip을 이용한 방법이 대두되었다. 그러나 이러한 실험 방법들은 많은 시간과 시료가 소모되고, 불임 진단에 있어서 정확성과 신빙성의 차이를 보이고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 본 연구에서는 형광 비드를 이용한 Luminex system을 이용하였다. 이 방법을 사용할 경우 여러 번으로 나누어 PCR 실험을 할 필요 없이, 한 번에 multiplex PCR을 수행한 후 gel 상의 증폭 밴드 이미지가 아니라, luminex system을 통해 산출되는 수치화된 데이터를 얻을 수 있다. 그러나 luminex system은 현재 단백질 research 분야에서는 활발하게 적용되고 있으나, oligo-nucleic acid array분야에서는 그 사용 빈도가 미미하다. 단백질 research 경우 사용되는 detector antibody(antigen)의 수가 한정되어 있어 시중에 판매되고 있는 제품을 사용하여 실험하게 하기 때문에 이들 antibody(antigen)을 이용한 luminex system 전문 kit가 개발되어 제품화되어 있어 이를 이용해 쉽게 실험할 수 있으나 oligo-nucleic acid array 분야의 경우, 실험자에 의해 수백 수억의 서로 다른 oligo-nucleic acid를 디자인하여 사용할 수 있기 때문에 이를 위해 개발, 시판되어 있는 kit가 없기 때문이다. 이러한 이유로 본 연구에서는 luminex system을 이용해 oligo-nucleic acid를 detection 할 경우 최적 실험 조건을 확립하고, luminex system이 남성 불임의 중요 원인 중 하나인 Y 염색체 상의 미세결실 여부를 판별하는데 적합한 방법인지 검증하였다. 그 후, 남성 불임 환자의 genomic DNA를 이용해 반복 실험을 수행하여 Y 염색체 상의 미세결실 여부를 가늠하는 객관적인 지표 값을 확정하였다. 기존 논문 내용과 참고 논문, Y 염색체 지도 등의 정보를 토대로 한국 불임 남성에서 결실 빈도가 높게 나타난 sY82 (이하 AZFa), sY83, sY87, sY124 (이하 AZFb), sY127, sY133, sY134, sY143 (이하 AZFc), sY148, sY152, sY158, sY159, sY283, sY586, SPGY1 등 15 종류의 STS 마커 후보를 선정하였다. 또한 PCR 반응의 양성 대조군으로 Y 염색체에 존재하는 SRY 유전자 특이적인 primer 쌍을 사용하였다. 선정된 후보 STS 마커의 primer와 probe 세부 서열 디자인은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 UniSTS(Fig. 2)의 정보와 Lasergene PrimerSelect (DNASTAR Inc, WI USA)(Fig. 12)를 이용해 수행하였다. 후보 STS 마커는 single PCR , multiplex PCR, single luminex detection, multiplex luminex detection 과정을 거쳐 최종 SRY, sY143, sY148, sY158, sY586, SPGY1을 사용하였다. 각 실험군에 맞춰 단순 single PCR 실험을 수행한 결과와 luminex system을 이용한 실험 결과는 일치 하였다. 이는 적은 시간과 비용, 적은양의 시료를 이용하는 multiplex luminex system으로도 Y 염색체 상의 미세결실 여부를 판별할 수 있음을 나타낼 뿐 아니라 luminex system을 통해 산출 되는 수치화된 데이터를 이용해 실험군의 결과를 분석하여 객관적인 지표를 제시할 수 있는 장점이 있다. 실제로 본 연구를 통해 남성 불임 여부를 가늠하는 객관적인 지표 값으로 intensity 180으로 정하고 그 이하 일 경우는 결실 된 것으로 판단하였다. 이것은 luminex system을 이용한 남성 불임 진단이 가능하다는 것을 말하며, 남성 불임 진단 뿐 아니라 다른 유전적 질병에 대한 진단 역시 가능하다는 것을 의미한다. 그리고 luminex system을 이용한 실험은 PCR 방법에 비해 짧은 시간에 세분화된 결과를 얻을 수 있어 실험 시간 단축과 실험 비용 절감 효과를 얻을 수 있다.; About eighteen percent of couples encounter difficulty procreating. Infertility caused by male has been identified in 50% of infertility cases. Microdeletion of the arm of the Y chromosome are associated with spermatogenic failure and have been used to define three regions on Yq(AZFa, AZFb, AZFc) that are critical for spermatogenesis. The basic components of microdeletion of Y chromosome related male infertility detection methodologies are assay chemistry and analysis platform. Characteristic genotyping technologies include both solid phase (gels) and homogeneous solution assays formats. However, there is some limit to apply these conventional methods in infertility clinics. Mainly due to its specificity, accuracy and time-consuming procedure. Some laboratories produced uncertain results(obscure band or double band) from these diagnosis for some STSs. The Luminex xMAP offers a new platform in high-throughput nucleic acid detection. The purpose of this study was to apply Luminex xMAPTM Technology as a diagnostic tool for infertility males. In order to improve specificity and accuracy of male infertility diagnosis, we have developed the Luminex xMAP system. Six loci, including sex-determining regions on the Y chromosome and five sequence-tagged sites in azoospermia-factor regions were investigated in infertile male patients. Extracted genomic DNA from infertile male blood was used multiplex polymerase chain reaction(PCR). We amplified multiplex PCR to achieve specific Cy3 labeled primer sets. This was hybridized according to capture probes. A multiplexed PCR-attached liquid with unique fluorescent bead was arrayed for the simultaneous detection using Luminex xMAP . Our method developed a sensitive signal, which showed the presence or absence of the STS regions on the Y chromosome. Therefore, the Luminex xMAP system is a more useful tool for molecular diagnosis of male infertility than PCR diagnostic tools in a clinical laboratory. This study has contributed to develop new methodologies for male infertility diagnosis using the Luminex xMAP system.