주화성을 이용한 운동성 정자 분리 마이크로바이오칩 개발

Abstract

최근에 들어 남성 불임은 점점 증가하고 있는 추세에 있다. 불임으로 진단 받은 남성은 정상적인 방법으로 수정이 불가능하기 때문에 난자 내 정자 직접 주입법을 통해 인공수정을 해야만 한다. 하지만 남성불임을 보이는 정액샘플에서 운동성 정자를 분리하는 방법은 확립되지 않았으며, 아직까지 많은 연구실에서 새로운 분리법을 개발 중에 있다. 특히, 세포 내 정자 직접 주입법(ICSI, intracellular sperm injection))은 정자의 자연 선택을 무시하기 때문에 높은 출산율과 건강한 후손을 얻기 위해서는 효율적인 인공선택을 하여야 한다. 따라서 난자 내 정자 직접 주입법을 위한 직진 운동성 정자 분리법이 필요하게 되었다. 나는 마이크로칩을 이용하여 직진 운동성 정자 분리법을 개발하고자 하였다. 본 연구에서 사용된 마이크로칩의 주된 재료로는 생체친화적인 PDMS(poly- dimethylsiloxane)와 pyrex glass를 사용하였으며 마이크로칩 형상은 확산이 잘 일어날 수 있게 고안되었으며 8개의 마이크로채널이 있기 때문에 마이크로칩 상에서 선별적 분석이 가능하였다. 생체 내 주화성이 일어나는 환경과 유사하게 조성하기 위하여 형광 실험을 통해 농도 화학적 구배를 형성시킬 수 있는 최적의 조건을 찾았다. 정자는 사람과 주화성에 유도되는 성질과 행동 성향이 비슷한 마우스 정자를 모델로 사용하였으며 화학 유인 물질은 마우스 정자에게 가장 잘 반응을 보이는 것으로 알려져 있는 아세틸콜린(acetylcholine)과 아드레날린(adrenalin)을 선정하였다. 마이크로칩의 채널을 채우는 완충용액로는 사람의 난관의 체액과 조성을 유사하게 만든 HTF(human tubal fluid) medium을 사용하였고 각 화학물질의 주입은 마이크로채널내의 마우스 정자의 이동을 방해하는 흐름을 방지하기 위하여 각각의 아웃렛 바로 위에서 밀어 넣는 것이 아니라 떨어뜨렸다. 5분 후에 인렛에 정자를 주입하고 10분 후에 현미경으로 관찰하여 각 농도별로 화학물질이 들어간 아웃렛의 정자 수를 측정하였다. 결과적으로 우리는 두 가지 화학물질에 대한 최적의 농도 범위를 찾는 것과 동시에 직진 활동성 정자을 주화성에 의해 분리해 낼 수 있었다. 그리고 마이크로칩의 특성을 이용하여 기존의 주화성 검사와 비교하였을 때 8개의 멀티채널로 인하여 시간을 단축시켰으며, 반응시료를 줄일 수 있었고 세포 내 정자 직접 주입법을 위한 새로운 직진 운동성 정자 분리법 개발을 성공하였다.; As time goes by, male infertility rate is increasing more and more. Because men diagnosed as infertility is impossible to fertilize through natural selection, they must have pregnant by artificial insemination. But not yet motile sperm separation techniques from severe semen sample present until now, so many laboratory is developing new separation methods. And especially because ICSI bypasses all normal sperm selection processes, it is important to have an efficient artificial selection process to maximize the probability of successful pregnancy, birth, and healthy offspring. Therefore, progressive motile sperm separation method became need. We attempted to develop progressive motile sperm separation tools using microchip. In this study, main materials of microchip were biocompatible PDMS and pyrex glass. And the form of microchip was designed for diffusion to make chemical gradient well. Additionally, because eight microchannel present per chip, choice assay was possible on microchip. To give circumstance similar to in vivo environment occurred chemotaxis, We found optimal condition making concentration chemical gradients with fluorescence experiments. Mouse sperm is used as model of human sperm, and acetylcholine and adrenaline were selected as chemoattractants of mouse sperm. HTF medium was utilized as buffer filling microchannel, and each chemoattractant was dropped carefully to prevent flow that inhibit movement of mouse sperm. After 5 minutes, inlet was injected with sperm solution. And again after 10 minutes, sperm counting was done as each concentration using microscopy. Consequently, we could find optimal concentration of the two chemoattractants and separate progressive motile sperm by chemotaxis at the same time. We reduced reagents volume, and shortened incubation time. And finally, we provided motile and mature sperm selection for the potential use in ICSI.