전사인자 CP2c와 YY1간의 전사 활성능 억제

Abstract

전사인자 CP2c는 생쥐의 알파 글로빈 유전자의 전사활성인자로 처음 동정되었으며 모든 조직에서 발현하고, DNA 복제와 세포 생존에 관여하는 Thymidylate Synthase (TS) 및 c-fos 유전자의 발현을 조절하여 일반적인 세포 특성을 유지하는데 관여하는 단백질로 알려져 있다 (Powell et al., 2000). 그러나 아직 CP2c의 기능조절에 대한 분자수준의 기작은 거의 밝혀진 바가 없다. 본 연구실에서는 효모 이중 보합법 및 파지전시 방법을 이용하여 CP2c 결합 단백질 및 결합 모티프를 동정하였다. 이를 통해 전사인자 YY1, SUMOylation 관련 효소 (PIAS1, UBC9, SUMO-1), chromatin remodeling 복합체/histone modifying 복합체 (BRD7 및 Mi-2 complex p66 소단위체), 세포사멸 관련 유전자 (TTRAP, REST) 및 신호전달 관련 유전자 (PKCδ, CKII) 등이 동정되었다. 또한 새로운 CP2c 결합 펩티드 모티프로서 HXPR, ARS, PHL 및 PXHX도 동정되었다 (Kang et al., 2005b). 본 연구에서는 CP2c와 YY1 상호간의 기능조절기전을 규명하였다. CP2c와 YY1 유전자의 세포 내 위치를 확인하기 위해, HEK 293T (인간 배아 신장 세포주) 세포와 K562 (인간 골수성 백혈병 세포주) 세포에 CP2c와 YY1 유전자를 형질도입 하였다. 면역염색법을 통해 두 유전자가 핵 내에 존재함을 확인하였고, 두 전사인자간의 전사활성 조절을 분석하기 위해 CP2c의 표적유전자인 알파-글로빈 프로모터 내의 CP2c 결합부위 4 copy를 붙여 만든 합성 프로모터 및 YY1 표적 유전자인 type I collagen (Col1a1) 프로모터를 사용하여 luciferase 분석을 수행하였다. CP2c에 의한 알파-글로빈 합성 프로모터의 활성화는 YY1의 과발현에 의해 억제되었으며, 반대로 YY1에 의한 Col1a1 프로모터의 활성화는 CP2c의 과발현에 의해 억제되었다. 이러한 CP2c와 YY1의 전사활성 억제기작을 분석하기 위해, 두 전사인자의 DNA 결합능을 Electrophoretic Mobility-Shift Assay (EMSA)를 통하여 분석하였다. 그 결과 YY1은 표적유전자의 프로모터 DNA에 결합한 CP2c와 결합하지만 YY1 단독으로는 DNA에 결합하지 않음을 확인하였다. 그러나 CP2c는 YY1-DNA 복합체와 결합하지 않았고, DNA에 단독으로 결합하지도 않았다. 따라서 YY1이 CP2c-DNA 복합체와 상호작용을 통해 전사 활성능을 억제하는 반면, CP2c에 의한 YY1 전사 활성능 억제는 표적유전자의 프로모터 DNA에 결합하는 YY1의 DNA 결합능에 아무런 영향을 주지 않으므로 CP2c에 의한 YY1의 전사활성 억제기작은 단백질 번역과정, 혹은 번역과정 후에 일어날 것으로 추측된다. 이러한 억제기작을 분석하기 위해 HEK 293T 세포에 CP2c와 YY1을 발현시킨 후 두 전사인자의 단백질 양을 확인해본 결과, CP2c의 발현양이 증가함에 따라 YY1 단백질 양이 크게 감소함을 확인하였다. 그러나 CP2c 과발현에 따른 YY1의 mRNA 변화량은 차이가 없었으며, CP2c가 YY1 단백질의 반감기를 1시간 정도 감소시킴을 확인하여 CP2c에 의한 YY1 단백질의 양적 감소는 단백질 분해에 의한 것임을 확인하였다. 이러한 단백질 분해 현상이 어떠한 단백질 분해 경로를 통해 일어나는지를 분석한 결과, CP2c는 26S proteasome 경로를 통해 YY1 단백질의 분해를 유도함을 확인하였다. 따라서 YY1은 CP2c-DNA 복합체에 결합, CP2c의 전사 활성능 억제를 유도할 것으로 유추되며, CP2c는 26S proteasome 경로를 경유하여 YY1의 단백질을 분해함으로써 YY1의 전사 활성능을 감소시킴을 확인할 수 있었다.; CP2 was identified initially as a transcription factor that binds to and stimulates transcription from the murine alpha-globin promoter. CP2c participates in cell cycle regulation by binding to and thus modulating transcription from the thymidylate synthase (TS) and c-fos promoter. Yeast two-hybrid and phage display revealed variouse proteins that bind to CP2c such as [PIAS1, UBC9, SUMO-1, chromatin remodeling complex/histone modifying complex (BRD7, Mi-2 complex p66 sub-complex), TTRAP, REST, PKCδ and CKII-α] and identified some novel peptide motifs which play on important role in the interaction between CP2c and it’s binding partners. In this study, we found that functional cross-antagonism between transcription factors CP2c and YY1. We reported that the transcription factor CP2c directly interacts with a nuclear protein Yin-Yang1 (YY1) via HGPR sequence (amino acids 320-323). YY1 is known to function as a transcriptional activator or repressor. It was also shown that the suppressing effect of YY1 on the CP2c’s transcriptional activity was lost by the point mutation on the HGPR sequence of YY1 (P322A/R323A). Also, YY1 binds to the DNA-bound CP2c, whereas CP2c does not interact with DNA-bound YY1. Based on these findings, we questioned whether CP2c reciprocally affect on YY1-mediated gene expression. Interestingly, we found that CP2c strongly repressed YY1-mediated type I collagen gene (Col1a1) expression, and this repression was accompanied by decreasing of YY1 protein. CP2c reduced the half-life of YY1 significantly, so we concluded that CP2c induced YY1 protein degradation. Moreover, ectopically expressed CP2c could degrade endogenous YY1 protein. We also detected that YY1 with a point mutation in HGPR sequence escaped from CP2c mediated degradation. These results indicate that direct interaction between CP2c and YY1 is critical for this degradation. Treatment of 26S proteasome inhibitor MG132 and 20/26S proteasome inhibitor MG101 block CP2c-mediated YY1 degradation. So, we concluded that CP2c induced YY1 protein degradation via 26S proteasomal pathway. Taken together, our findings suggested that CP2c degrade YY1 protein through their direct interaction and the physiological role of YY1 can be regulated by the cellular concentration of CP2c. Moreover, we identified that CP2c and YY1 proteins are reciprocal reverse-expression in variety of cell lines.