인간 배아줄기세포의 특성 유지와 분화에 있어서 STELLAR (DPPA3/STELLA/PGC7) 유전자의 기능 분석

Abstract

줄기세포 (stem cell)는 자가 증식능 (self-renewal) 및 다분화 (pluripotency) 능력을 보유한 세포로서 삼배엽성의 모든 세포로 분화 가능한 특성을 가진다. 본 연구에서는 이러한 줄기세포의 특성을 조절하는 유전자를 cDNA microarray와 in silico 분석을 통하여 동정하였으며 (Kim et al., 2006), 이 중 STELLAR (DPPA3/STELLA/PGC7) 유전자를 대상으로 렌티바이러스 RNAi 시스템을 이용하여 STELLAR 유전자가 인간 배아줄기세포의 특성 유지 및 분화 과정에 미치는 영향을 분석하였다. 인간 배아줄기세포의 자가 증식능에 STELLAR 유전자가 미치는 영향을 알아보기 위해 렌티바이러스를 이용하여 STELLAR RNAi를 인간 배아줄기세포에 도입하였고, 형광 현미경 하에서 EGFP가 발현되는 세포만 선별하여 세포주를 확립하였다. 확립된 STELLAR RNAi 세포주에서 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 통해 STELLAR 유전자의 발현이 대조군 대비 약 75% 감소하였음을 확인하였다. STELLAR 유전자의 발현이 감소되었음에도 불구하고 미분화 마커인 POU5F1, NANOG, SSEA-1, SSEA-4, Tra1-60 그리고 Tra1-81의 발현이 대조군과 차이가 없음을 확인하였다. 또한 40계대 이상 미분화 상태를 유지하며 증식이 가능한 점으로 볼 때, STELLAR 유전자는 인간 배아줄기세포의 미분화 유지 및 자가 증식능력에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 인간 배아줄기세포의 분화 과정 동안 STELLAR 유전자가 미치는 영향을 분석하기 위하여 배아체 (Embryoid Body: EB) 형성을 통해 인간 배아줄기세포의 분화를 유도한 후, 삼배엽 특이 표지유전자의 발현 양상을 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응 방법으로 분석하였다. 분석 결과 분화 초기에 내배엽 표지 유전자인 α-fetoprotein의 발현이 대조군에 비해 약 20배 감소되었고, 이를 면역 조직 화학 염색법을 통하여 단백질 수준에서 분석하였을 때에도 동일한 결과를 보였다. 이러한 결과를 통해 STELLAR 유전자는 초기 내배엽 분화 운명결정에 중요한 인자임을 확인할 수 있었다. 결론적으로 인간 배아줄기세포에서 STELLAR 유전자는 인간 배아줄기세포의 미분화 유지에 관여하지 않고, 초기 내배엽 분화의 운명결정에 중요한 인자임을 유추할 수 있었다.; Stem cells are cells capable of both self-renewal and maintenance of pluripotency to differentiate. To identify genes implicated in the control of the stem cell state, we have analyzed the expression profiles of genes in hESC using cDNA microarrays and in silico analyses and then selected target genes (Kim et al., 2006). Among genes highly abound in hESCs, we determined here the functional role of STELLAR (DPPA3/STELLA/PGC7) in self-renewal and differentiation of hESCs with a lentiviral RNAi system. To analyze the effect of STELLAR in self-renewal of hESCs, we transduced the STELLAR RNAi vector into hESCs and established the STELLAR RNAi cell lines by monitoring GFP expression under the fluorescence microscope. The expression level of STELLAR in transduced cells was indeed reduced up to about 75% of the control as revealed by real-time RT-PCR. Also, the transduced cells expressed the stem cell markers, POU5F1, NANOG, SSEA-1, SSEA-4, Tra1-60 and Tra1-81, and the level of expression was similar to control. These cell lines were maintained their undifferentiated state for more than forty weeks with reduced expression of STELLAR, suggesting that STELLAR is dispensable for the maintenance of self-renewal of hESCs. Potential involvement of STELLAR in hESC differentiation was analyzed by monitoring lineage specific gene expression during EB differentiation using real-time RT-PCR. An endoderm marker α-fetoprotein was dramatically obstructed in its expression during EB differentiation with no significant deviation of other lineage specific markers. The expression pattern was similar to the protein level shown by immunohistochemistry. Thus, our data suggest that STELLAR is essential in the fate decision of early endoderm differentiation. In conclusion, STELLAR is essential for early endoderm differentiation, but not for the maintenance of self-renewal of human embryonic stem cells.