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Mining of Potential Biomarker Gene for Assessing Impacts of Endocrine Disruptors in the Self-fertilizing Fish, Rivulus marmoratus

Title
Mining of Potential Biomarker Gene for Assessing Impacts of Endocrine Disruptors in the Self-fertilizing Fish, Rivulus marmoratus
Other Titles
암수동체 어류 점박이송사리에서 내분비계장애물질의 영향 평가를 위한 잠재적 생체 지표 발굴에 관한 연구
Author
이영미
Alternative Author(s)
Lee, Young-Mi
Advisor(s)
이재성
Issue Date
2007-02
Publisher
한양대학교
Degree
Doctor
Abstract
인류의 다양한 활동을 통하여 수서 생태계로 유입되는 인위적인 화학물질과 오·폐수는 수서 생물의 생식과 발생에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 왔다. 이러한 오염물질, 특히 내분비계장애물질은 체내로 유입되어 정상적인 호르몬 체계를 방해할 수 있다. 따라서 생식소 구조와 기능의 변화, 수정란 생성의 억제, 성비 교란, 성적 행동의 방해등과 같은 치명적인 효과를 초래하여, 결과적으로는 개체, 자손, 심지어 군집의 생존에 까지 영향을 미칠 수 있다. 그러므로 이러한 독성물질에 대해 효과적인 방법을 사용하여 대량으로 모니터링 할 수 있는 시스템을 개발하고, 나아가 이러한 물질들의 위해성 평가를 위한 기반을 마련하는 것이 시급한 실정이다. 최근에는 이러한 요구에 부합하기 위해 다양한 분자 수준의 생체지표 (biomarker)가 보고되고 있고, 이를 대체할만한 새로운 생체지표를 개발하기 위해 척추 및 무척추 수서 생물로부터 microarray 와 같은 유전체 연구에 사용되는 다양한 분자적 방법을 이용하여 대량의 미동정 유전자들을 찾고있다. 본 연구에서는 Expressed sequence tag (EST) 분석과 differential display RTPCR (DD RT-PCR) 방법을 이용하여 잠재적인 분자생체지표를 발굴함으로 암수동체 어류인 점박이 송사리 (Rivulus marmoratus)를 실험실 연구에서 환경 독성 연구 분야를 위한 모델 종으로서 제시하고자 하였다. 추가로, glutathione S-transferase (GST) isoform 과 cytochrome P450 aromatase 의 유전자 특성을 분석하였고, 이들 유전자 발현에 대한 내분비계장애물질의 영향을 real-time RT-PCR 을 이용하여 조사하였다. R. marmoratus 로부터 1.0 x 106 pfu 의 cDNA 라이브러리를 얻었으며, 1,577개의 클론을 무작위 적으로 선택하여 5’-말단 부위 쪽에서 염기서열 분석을 실시 하였다. 각 클론은 medaka EST 데이터 베이스와 zebrafish EST 데이터 베이스와 각각 blastX 를 통해 각각 1,518 과 1,519 개의 상응하는 유전자를 얻었다. 이들 유전자 중에서 Unigene ID 를 갖는 것은 각각 197 과 115 개의 유전자 였다. Medaka EST 데이터 베이스와 비교하여 얻은 유전자 클러스터에서 단독으로 존재하는 클론은 136 개 였고, unknown 클론은 770 개 였다. 가장 많은 클론을 포함하는 유전자는 nuclear protein H731 로 276 개의 클론이 이에 해당하였으며, parvalbumin 은 95 개의 클론이 이에 해당하여 두번째로 빈도수가 높은 유전자로 분류되었다. 이와 비교하여, zebrafish EST 데이터 베이스와 비교한 경우 얻어진 유전자 클러스터는 좀 더 다양하게 분포하였으며 59 개의 단독 클론과 525 개의 unknown 클론이 동정되었다. 가장 빈도수가 높은 유전자는 PKC - potentiated inhibitory protein 으로 138 개의 클론이 이에 해당하였으며, parvalbumin 은 80 개의 클론을, enolase alpha 는 79 개의 클론을 포함하여 각각 두번째와 세번째로 많은 클론을 포함하는 유전자였다. Annotated gene 중 대부분이 세포내 생리 및 대사에 관여하는 유전자 였으며, 세포내 혹은 세포내 기관에 분포하는 유전자이며 단백질 결합이나 가수분해 활동을 하는것으로 밝혀졌다. 또한 각 EST 데이터 베이스와 상응하는 유전자들 중에서 생체지표 로서의 잠재성을 갖는 유전자를 제시하였다. Medaka EST 데이터 베이스와 상응하는 유전자들 중에는 해독관련 유전자 (glutathione S-transferase, aldo-keto reductase), 항산화 효소 (glutathione peroxidase), 발암 유전자 (tumor necrosis factor receptor-associated protein, BCL2-associated athanogene), 스트레스 관여 유전자 (heat shock protein 90, ferritin), 그리고 스테로이드성 호르몬 유전자 (11β- hydroxysteroid dehydrogenase)가 유용한 유전자로서 제시되었다. 한편, zebrafish EST 데이터 베이스와 상응하는 유전자들 에서는 parvalbumin, heat shock cognate, 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, and androgen receptor 가 추가적으로 제시되었다. 이러한 연구 방법은 유전자를 얻기 용이하며, 미동정된 유전자를 동정하는데 매우 유용한 방법이다. 결과적으로, 본 연구에서 얻은 클론은 종 특이적인 cDNA chip 을 만들어 R. marmoratus 를 대상으로 독성 유전체학 연구에 이용될 수 있으며, 이전에 보고된 다른 경골 어류의 ESTs 와 비교하므로서 비교 유전체학 연구에도 적용할 수 있을것이다. DD RT-PCR 연구를 통하여, 비스페놀 A 에 노출된 간 조직으로부터 56 개의 서로 다르게 발현되는 유전자를 얻었다. 이 유전자 중 16 개의 유전자가 클로닝, 유전자 서열 분석 및 blast X 검색을 통하여 동정되었으며, 이들 유전자는 주로 촉매작용 및 결합에 관여하는 유전자들로 밝혀졌다. 동정된 유전자는 스트레스 관련 유전자 (hsp90), 항산화 효소 (glutathione peroxidase), 해독관련 효소 (cytochrome P450 2K5), 촉매 대사 효소 (inositol oxygenase, betaine homocysteine S - methyltransferase, GTP cyclohydrolase I feedback regulatory protein, Aspartyl-tRNA synthetase, homogentisate oxygenase), DNA 결합 단백질 (zinc finger protein, forkhead box), 면역 방어 관련 단백질 (Fetuin-B, scavenger receptor), 스테로이드 호르몬 에 반응하는 단백질 (vitellogenin, TBTbinding protein) 이었다. 비스페놀 A 를 각각 300 ㎍/L 와 600 ㎍/L 처리한 간 조직에서 real time RT-PCR 을 이용하여 이들 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 본 연구 결과는 DD RT-PCR 방법을 토대로한 ACP-based 시스템이 환경 독성 물질의 노출에 대해 서로 다르게 발현되는 유전자를 동정하는데 유용함을 증명하였다. 나아가 본 연구 방법은 다양한 독성 물질을 모니터링 하기위한 분자 바이오마커를 개발하는데 유용할 것으로 사료되며, 추후에 바이오마커 microarry 를 제작하여 쉽고 빠르게 환경 오염 물질의 유해성을 평가하는데 이용될 수 있을것이다. 본 연구에서는, 또한 phase II 해독 관련 단백질로 알려져 있는 glutathione S-transferase 와 안드로겐에서 에스트로겐으로의 전환을 촉매하는 단백질로 알려진 cytochrome P450 aromatase 를 대상으로하여 유전자의 특성을 분석하고, 나아가 내분비계장애물질에 대한 이들 유전자의 발현 변화를 분석하였다. 먼저, rm-GST 유전자는 알파 와 세타 타입의 두 종류의 isoform 을 비교 분석 하였다. rm-GST-A 유전자의 cDNA 길이는 961 bp 였으며, 666 bp 의 ORF, 5’ 과 3’ 말단 비전사 부위를 포함하고 있었다. 이 cDNA 는 아미노산 서열 221 개, pI 값 7.8 과 25.3 kDa 의 분자량을 갖는 단백질을 암호화 할것으로 추정되었다. 한편, rm-GST-T cDNA 는 666 bp 의 ORF 를 포함하여 전체 길이가 907 bp 였으며, 아미노산 서열 221 개의 pI 값 8.5 를 갖는 분자량 25.8 kDa 의 단백질을 암호화 할 것으로 추정되었다. 두 isoform 은 모두 N 말단과 C 말단에 보존된 GST 도메인을 가지고 있었다. 또한 genomic DNA 구조에서도 모두 6 개의 exon 으로 구성되어 있었고 exon - intorn junction 부위도 GT-AG 규칙을 잘 따르는 것으로 판명되었다. 이들 두 type 의 rm-GST 아미노산 서열의 유사도는 14%로 서로 다른 isoform 임을 알 수 있었고, 계통도를 통하여 rm-GST-A 와 그-GST-T 유전자가 각각 서로 다른 어류의 알파 타입 혹은 세타 타입과 가까운 유연관계를 나타내었다. 조직 분포를 보면, rm-GST-A 는 Rivulus 성체의 전체 조직에서 고르게 분포하고 있으며, 특히 생식소, 간, 그리고 장에서 높게 발현되었다. 그에 반해 rm-GST-T 는 간과 장에서 주로 발현되었으나 rm-GST-A 에 비하면 발현양은 상당히 낮았다. 재조합된 rm-GST-A 와 rm-GST-T 단백질은 His-tag affinity column 을 통하여 정제하였으며, 각각 25.3 kDa 과 25.8 kDa 의 크기의 single band 를 보이는 단백질을 얻었다. 재조합 rm-GST-T 단백질의 Vmax 값은 rm-GST-A 단백질 보다 약 3 배 가량 높았다. 이는 rm-GST-T 단백질이 CDNB 와의 결합을 촉매하는 능력이 rm-GST-A 보다는 더 높다는 것을 의미한다. 두 재조합 단백질은 각각 pH 9 (rm-GST-A)와 pH 8 (rm-GST-T)에서 가장 높은 효소활성을 보였으며, 25 도 에서 50 도까지 그 활성을 유지하였다. Inhibition assay 에서, rm-GST-T 는 cibacron blue 와 hematin 에 대해 rm-GST-A 보다 더 민감한 것으로 나타났으나 N- ethylmaleimide 에 대해서는 두 단백질이 거의 유사한 억제 효과를 보였다. 본 연구 결과를 통하여, 재조합된 두 종류의 rm-GST 단백질이 모든 생명체에서 보존되어 진화되어온 GST 의 기능을 보존하고 있으며, 효소 활성에서 다소 차이를 보였다. 96 시간 독성 실험에서, rm-GST-A mRNA 는 비스페놀 A 와 노닐페놀을 처리했을 때 발현이 감소하였으나, rm-GST-T mRNA 는 크게 영향을 받지 않았다. 그러나 처리 시간에 따른 독성 실험에서, rm-GST-A 와 rm-GST-T mRNA 는 노닐페놀을 3 시간 처리했을 때 발현이 증가하였으며, 그 이후에 시간이 지남에 따라 서서히 감소하였다. 따라서 이는 rm-GST 유전자가 독성물질에 노출된 후 상당히 초기에 화학물질에 의해 유도되거나 혹은 대사를 통해 발생하는 산화적 스트레스에 대하여 스스로 방어하거나 혹은 외부 유입 물질을 해독하는데 참여할 것으로 사료된다. 두번째로, R. marmoratus 의 gonad 와 brain 으로부터 각각 rm-cyp19a (ovarian aromatase)와 rm-cyp19b (brain aromatase)를 클로닝하였다. Rm-cyp19a 유전자의 전체 cDNA 길이는 2,075bp 로 1,551 bp 의 ORF 를 포함하고 있었다. 이는 아미노산 서열 516 개의 pI 값 6.87 인 53.29 kDa 의 단백질을 암호화 할것으로 추정되었다. 한편, rm-cyp19b cDNA 는 1,518 bp 의 ORF 를 포함하며 전체 2,124bp 길이를 보였고, 아미노산 서열 505 개의 pI 값 7.94 인 57.37 kDa 의 단백질을 암호화 할것으로 추정되었다. 이들 두 유전자는 I-helix region, aromatic region, and heme-binding region 와 같은 종 전반에 걸쳐 상당히 보존된 도메인을 갖는것으로 나타났다.조직 분포도를 보면, rm-cyp19b mRNA 는 암수동체와 2 차 수컷에서 모두 brain 에서 우세하게 발현한 반면, rm-cyp19a mRNA 는 gonad 에서 성 특이적으로 발현하였다. 전반적으로, rm-cyp19b 유전자와 비교했을 때, rmcyp19a 유전자의 발현이 상당히 낮은 것을 알 수 있었다. 따라서 내분비 장애물질에 대한 이 두 유전자의 발현 양상의 변화를 brain 과 gonad 에서 추가로 조사하였다. rm-cyp19b 는 96 시간 노닐페놀에 노출된 암수동체와 2 차 수컷의 brain 에서 상당히 높게 발현이 증가한 반면, rm-cyp19a 유전자는 암수동체의 gonad 에서 감소하는 양상을 보였다. 옥틸페놀과 비스페놀 A 에 노출된 brain 과 gonad 에서, rm-cyp19a 와 rm-cyp19b 유전자는 모두 발현이 증가하였으며, 전체 실험에서 rm-cyp19a 유전자는 2 차 수컷의 gonad 에서 전혀 발현되지 않았다. 본 연구 결과는 rm-cyp19a 와 rm-cyp19b 유전자가 에스트로겐 성질을 갖는 화합물의 종류와 성별에 따라 서로 다르게 조절된다는 것을 의미하며, 특히 rm-cyp19b 유전자는 rm-cyp19a 유전자에 비해 내분비계 장애물질에 대해 좀 더 민감하게 반응 할 수 있음을 보여 주고, 따라서 점박이 송사리의 aromatase 특히, cyp19b 유전자는 이들 화학물질에 대한 유용한 잠재적인 생체지표로서 이용가능할 것이다.; A diverse range of chemicals, sewage, and wastewater flows into aquatic environment from various activities of human beings. Their adverse effects on the reproduction and development of aquatic organisms have been recognized in several laboratory and field investigations. Special interest has been focused on endocrine disrupting properties of environmental toxicants, because these chemicals mimic estrogen, and disrupt normal hormone pathway, consequently cause the harmful effects such as a change of structure and function of gonad, reduced egg production, skewed sex ratio, and alteration of sexual behavior, on individual, its progeny, or even populations. Therefore, development of robust and powerful monitoring system and establishment of the basis for risk assessment of these deleterious environmental toxicants have been needed urgently. Recently, addressing to these needs, several molecular biomarkers are already well - documented. Nevertheless, there is a huge scope to develop alternative biomarkers and to identify genes which have been unassigned in aquatic vertebrates and invertebrates using molecular biology techniques. In this study, expressed sequence tags (ESTs) analysis and differential display RT-PCR were used for mining genes which have potential as potential biomarkers from Rivulus marmoratus, and ultimately to develop this species as a model animal for environmental toxicological study in laboratory research. Additionally, two glutathione S-transferase subtypes and cytochrome P450 aromatase were characterized, and their gene expression patterns by endocrine disrupting chemicals were investigated The primary titer of R. marmoratus cDNA library was about 1.0 x 106 pfu, and 1,577 clones were randomly picked and sequenced from the 5’-end. Each clone corresponded to 1,518 and 1,519 genes of medaka dbEST and zebrafish dbEST, respectively. Among these matched genes with each EST database, 197 and 115 genes obtained Unigene ID in medaka dbEST and zebrafish dbEST, respectively. In the clusters from medaka dbEST, single clone was 136 and unknown clones were 770. The most abundant clusters was Nuclear protein H731, containing 276 clones of total 1,518 clones. Pavalbumin was second largest gene (95 clones). Compared to medaka dbEST clusters, those of zebrafish dbEST showed the wide range of size distribution including 59 of single clone and 525 of unknown clones. The most abundant clone was PKC-potentiated inhibitory protein (138 of total 1,519 clones). Also parvalbumin (80 clones), and enolase alpha (79 clones) were second and third largest gene, respectively. Most of analyzed genes mainly were annotated in cellular physiological process or metabolism, components of intracellular or organelle, and molecular functions as protein binding or hydrolase activity. Potential biomarkers such as detoxification-related gene (glutathione S-transferase, Aldo-keto reductase), antioxidant enzymes (glutathione peroxidase), oncogene-related gene (tumor necrosis factor receptor - associated protein, BCL2 - associated athanogene (BAG)), stress-response gene (HSP 90, Ferritin), and steroidogenic gene (11β-hydroxysteroid dehydrogenase) were detected. In DD RT-PCR study, 56 differential expressed genes were obtained from the liver - exposed to BisphenolA. Among differential expressed genes, 16 genes were identified, and annotated genes were mainly involved in catalytic activity and binding. These gene included stress response protein (hsp 90), antioxidant enzyme (glutathione peroxidase), detoxification enzyme (cytochrome P450 2K5), catalyzing metabolic enzyme (inositol oxygenase, betaine homocysteine S - methyltransferase, GTP cyclohydrolase I feedback regulatory protein, Aspartyl-tRNA synthetase, homogentisate oxygenase), DNA - binding protein (zinc finger protein, forkhead box), immune defense - related protein (Fetuin-B, scavenger receptor), steroid hormone response protein (vitellogenin, Tributyltin-binding protein). Expression pattern of these genes were confirmed by real-time RT-PCR with 300 ㎍/L and 600 ㎍/L of BisphenolA - exposed liver tissue. This finding suggests that potential biomarker genes from ESTs analysis and 16 differential expressed genes from DD RT-PCR could be applicable to assess environmental toxicants. Additionally, we completely sequenced, characterized biochemical properties of glutathione S-transferase (phase II detoxification enzyme) and cytochrome P450 aromatase (enzyme catalyzing conversion of androgen into estrogen) and investigated their gene expression patterns by endocrine disrupting chemicals. First, two type of rm-gst gene, alpha - class and theta - class were compared. The rm- gst -A gene had a 961 bp transcript, including 5' - untranslated region (UTR), 666 bp of open reading frame (ORF), and 3' - UTR. This cDNA encoded a polypeptide of 221 amino acids and this putative protein showed 7.8 of theoretical pI and 25.3 kDa of calculated molecular weight. On the other hand, the complete cDNA sequence of rm- gst -T gene was 907 bp in length and contained an open reading frame of 666 bp, encoding a polypeptide of 221 amino acids. The putative protein encoded by theta rm-gst cDNA was calculated in theoretical pI of 8.5 and molecular weight of 25.8 kDa. We found that rm-gst-A and rm-gst-T had conserved domain in N-terminal and C-terminal region. Both rm- gst -A and rm- gst -T gene consisted of 6 exons and accorded to the GT-AG rule at all exon - intron junctions. In phylogentic tree, rm- gst -A was clustered with other fish alpha-class GST, while rm- gst -T with other fish theta and theta-like class gst. The rm-GST-A was ubiquitously distributed in tissues of adult Rivulus with high expression of rm-GST-A in gonad, liver and intestine. However, rm- gst -T was highly expressed in liver and intestine with relatively lower transcripts than rm- gst -A. To determine whether rm-gst gene would be functional enzyme and compare the catalytic properties between these isoenzymes, we produced recombinant rm-GST-A and rm-GST-T purified by His-taq affinity column, each protein showed a single band with a molecular mass of approximately 25.3 kDa for rm-GST-A and 25.8 kDa for rm-GST-T. V max of rm-GST-T toward 1-Chloro-2, 4- Dinitrobenzene (CDNB)-conjugation as a substrate was approx. 3 times higher than rm-GST-A. This means that rm-GST-T would be better catalyst of CDNB conjugation than rm-GST-A. The optimum pH range of both rm-GSTs was at pH 9 for rm-GST-A and pH 8 for rm-GST-T. The recombinant rm-GST-A and rm-GST-T preserved their activity in the range of 25 ℃ to 50 ℃. In hibition assay, rm-GST-T was more sensitive to cibacron blue and hematin than rm-GST-A, while inhibition effect of N-ethylmaleimide on both of rm-GSTs was similar with each other. Our data revealed that the recombinant rm-GST-A and rm-GST-T are functional enzymes which has been conserved and evolved in all organisms. The rm-gst-A mRNA expression was down-regulated with statistically significance in 96 h - exposed group to 4-NP or BisA, while rm-gst-T mRNA expression was not shown the difference between non-treated and treated group. However, both rm-gst-A and rm-gst-T mRNA expression were highly induced in 3h-4-NP-treated group and decreased as time goes by. This finding implys that rm-gst genes would be involved in detoxification of xenoestrogen and protecting organisms from chemical-derived or endogenous oxidative stress as a phase II enzyme in early stage of exposure. Second, in this study, we detected two distinct cytochrome P450 aromatase isoforms from brain (rm-cyp19b) and ovary (rm-cyp19a) of R. marmoratus. The complete cDNA sequences of rm-cyp19a (ovarian aromatase) gene were 2,075 bp in length, including 1,551 bp of open reading frame (ORF) encoding a putative protein of 516 aa with a theoretical pI value of 6.87 and a calculated molecular weight of 53.29 kDa, 44bp of 5'-UTR region and 480bp of 3'-UTR region. In the case of rm-cyp19b (brain aromatase), the length of the complete cDNA sequences was 2,124 bp containing ORF of 1,518 bp, flanked by 5'-UTR of 186 bp, and long 3'-UTR of 420 bp The rm-cyp19b cDNA encoded a putative protein of 505 aa with a theoretical pI value of 7.94 and a calculated molecular weight of 57.37 kDa. From phylogenitic study, rm-cyp19a was clustered with other telost fish ovarian aromatase showing above 80 % identity and rm-cyp19b with other telost fish brain aromatase sharing 76 - 78 % identity. Meanwhile, the similarity of rm-cyp19a and rm-cyp19b was relatively low (58 %) when compared with each other. These genes appeared highly conserved domain, I-helix region, aromatic region, and heme-binding region. The rm-cyp19b mRNA was predominantly expressed in brain of both hermaphroditic fish and secondary male, while rm-cyp19a mRNA was expressed gender-specifically in the gonad. Compared to the rm-cyp19b gene, the abundance of ovarian aromatase rm-cyp19a transcripts was very low, and its expression was first detected at stage 3 and then decreased gradually to the hatching stage. Alteration of rm-cyp19b and rm-cyp19a gene expression was further analyzed in the brain and gonad, respectively, by real-time RT-PCR 96 h after EDC exposure in hermaphrodites and secondary males. In hermaphroditic fish, the rm-cyp19b gene was up-regulated in the brain after 4-NP-exposure, while the rm-cyp19a gene was significantly down-regulated in the gonad. In 300 μg/L 4-tert-OP, or 600 μg/L BisA-exposed brain and gonad, both rm-cyp19b and rm-cyp19a genes were up-regulated. In the case of secondary males, the rm-cyp19b gene was highly expressed in the brain 4-NP-exposed fish, while expression of the rm-cyp19a gene was not detected in the gonad. These results indicate that the expression of rm-cyp19a and rm-cyp19b genes could be differently modulated according to estrogenic compounds and gender type of R. marmoratus. Finally, it is suggested that Rivulus aromatase gene, especially rm-cyp19b may be a more sensitive than rm-cyp19a to exposure of endocrine disrupting chemicals, and could be useful potential biomarker for assessing effect of these chemicals.
URI
https://repository.hanyang.ac.kr/handle/20.500.11754/150071http://hanyang.dcollection.net/common/orgView/200000405457
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GRADUATE SCHOOL[S](대학원) > DEPARTMENT OF MOLECULAR AND ENVIRONMENTAL BIOSCIENCE(분자생명환경과학과) > Theses (Ph.D.)
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