임신 중 고열이 생쥐태아의 팔 근육형성관련인자에 미치는 영향

Abstract

사람에서 산모고열에 의한 중추신경계 기형 유발 가능성이 제기된 이후 현재까지 사람 및 실험동물에서 고열에 노출된 태아의 발생기전에 관한 다양한 연구결과가 발표되었다. 산모고열은 태아의 성장지연, 선천성기형 그리고 유산을 유발하는 주요원인 중의 하나이며, 중추신경계를 포함하여 여러 계통의 장기 발생에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고, 기형유발원인의 하나로 인정되고 있다. 그러나 산모고열에 대한 대부분의 연구는 외형적 기형 형성기전에 주로 중점을 두고 있고, 고열에 의한 발생시기별 체중변화와 유산율에 관한 정보는 매우 미흡하다. 또한 태아의 팔 근육을 대상으로 근육발생에 관여하는 여러 유전자와 단백질들이 고열노출로 인하여 어떤 발현양상을 보이며, 이로 인하여 근육발생에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 따라서 이 실험에서는 C57/BL6 생쥐를 이용하여 임신 8일에 고열에 노출시킨 후 태령 11, 13, 15, 17일 태아와 생후 1일 신생생쥐를 대상으로 체중을 측정하였고 유산율을 산출하였다. 또한 팔 근육조직에서 근육발생과 밀접한 관계를 갖고 있는 Pax3, FGF4, MyoD, Myogenin, myosin heavy chain (MyHc)의 발현양상을 추적하고자 RT-PCR, western blot, 면역조직화학염색을 시행하였으며, 생후 1일 신생생쥐에서 팔 근육의 미세구조를 투과전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 실험군 태아에서 유산율은 태령 11일에서 32.4%, 13일에서 40%, 15일에서 36.6%, 17일에서 44.8%였으며, 생후 1일의 사망률은 38.1%로 나타났다. 2. 실험군의 체중은 대조군에 비해 낮았고, 특히 태령 11일과 13일군은 유의한 차이(p<.05)를 보였다. 3. 팔 근육에서 대조군의 Pax3 유전자 발현은 태령 11일에서 높게 나타났다가 13일부터 급격히 감소하였다. 반면 실험군에서는 태령 13일에 여전히 높은 발현강도를 보였다. 4. 실험군 FGF4 유전자는 대조군에 비해 약하게 발현되었다. 5. 실험군의 MyoD 단백질은 대조군에 비해 낮게 발현되었고, Myogenin 단백질은 생후 1일 대조군에 비해 높게 발현되었으며, MyHc 단백질은 태령 17일에 대조군에 비해 높게 발현되었다. 6. MyoD, Myogenin 그리고 MyHc의 면역조직화학염색소견은 western blot 결과와 대동소이하였다. 7. 생후 1일 실험군의 팔 근육을 투과전자현미경으로 관찰한 결과 근육섬유는 각 띠가 불분명한 근육원섬유로 구성되어 있었고, 위성세포는 근육세포 밖에 위치하고 있었으며, 분열중인 근육모세포와 근육섬유의 가장자리에 분포하고 있는 신경섬유가 관찰되었다. 이상의 결과를 종합하면 산모고열은 근육전구세포의 이동과 관련된 유전자인 Pax3의 발현을 지연시켰고, 근육모세포의 증식을 조절하는 인자인 MyoD, FGF4의 발현을 억제하였다. 또한 근육대롱세포의 형성과 관련된 인자인 Myogenin의 발현을 지연시키고 근육섬유분화인자인 MyHc의 발현을 지연시켜 생쥐의 팔 근육형성과정에 영향을 미치는 것으로 생각된다.; Since the possibility of congenital anomalies in human central nervous system (CNS) by maternal hyperthermia has been suggested, diverse studies concerned in mechanisms of fetal development in both human and experimental animals performed. Maternal hyperthermia, which is currently confirmed as one of major causative factors inducing growth retardation, congenital anomalies, and abortion, is known to influence normal development of CNS and various organ systems. Although the effects of maternal hyperthermia on the normal development have been studied, many of them focused mainly on the mechanism of congenital anomalies based upon external anomalies. Little is known about weight changes and abortion ratio according to developmental periods in heat exposed fetuses. In addition, it is not clearly identified how maternal hyperthermia affects the expression of myogenesis-related genes or proteins in upper limb of mouse. To elucidate the effects of maternal hyperthermia on weight changes and abortion ratio as well as myogenesis in upper limb, pregnant mice, C57/BL6 strain, were heat-shocked at gestational day (GD) 8, and weight of fetuses and abortion ratio were calculated, and myogenesis related factors such as Pax3, FGF4, MyoD, myogenin, myosin heavy chain (MyHc) were detected at GD 11, 13, 15, 17, and postnatal day (PD) 1 using RT-RCR, western blot and immunohistochemistry. Upper limb muscle of neonate was observed with transmission electron microscope. The results obtained were as follow: 1. Abortion ratio in heat-shocked (HS) group was 32.4% on GD 11, 40% on GD 13, 36.6% on GD 15, 44.8% on GD 17 and 38.1% on PD 1, respectively. 2.Body weight (BW) of HS fetuses was lower than that of control fetuses. Especially, the BW of HS groups on GD 11 and GD 13 were significantly lower (p<.05) than control groups. 3. Pax3 gene was continuously highly expressed in GD 13 HS group. 4. FGF4 gene expression in HS group was more down-regulated than control group. 5. MyoD protein expression of HS group was shown lower than control group, and Myogenin protein was highly expressed in PD 1 HS group. MyHc protein expressions by GD 17 were higher than control groups. 6. Immunohistochemical studies for MyoD, Myogenin and MyHc were similar to western blot analysis. 7. In upper limb muscle of PD 1 HS group, myofibrils were made up of indistinct various bands and Z-line. Satellite cell was located outside myofiber. Dividing myoblast and peripherally attached nerve fibers were also observed. To summarize, maternal hyperthermia induced high abortion ratio and low body weight. It also resulted in delayed expression of Pax3 gene, inhibition of FGF4 gene and MyoD protein expression as well as delayed expression of Myogenin and MyHc proteins. Consequently, it is suggested that maternal hyperthermia may delay the development and maturation of muscle of the upper limbs in fetal mouse.