Phospholipase D1 as a key enzyme for decidualization in human endometrial stromal cells

Abstract

인지질 분해효소 D (Phospholipase D, PLD)는 세포막에 존재하는 인지질 말단의 phosphodiester bond를 가수분해하는 효소로서 세포의 증식, 분화를 비롯한 세포 내 다양한 활동을 매개하는 것으로 알려져 있다. decidualization은 자궁 내막 기질 세포에서 일어나는 형태적이고 생화학적인 분화과정을 나타내는데, 본 연구는 8-Br-cAMP 처리에 의해 발생하는 decidualization 과정에서 PLD의 역할에 관한 연구를 수행하였다. 사람의 자궁으로부터 분리한 자궁 내막 기질 세포에 0.5 mM 8-Br-cAMP를 12일 동안 처리하면 자궁 내막 기질 세포는 구형의 세포로 변하면서 다량의 prolactin와 IGFBP-1의 발현이 증가한다. 이 현상과 같이 PLD1의 mRNA와 단백질의 발현 양, PLD activity가 증가함을 본 연구를 통해 확인하였다. 또한 decidualization이 유도된 자궁 내막 기질 세포에 8-Br-cAMP를 제거하면 다시 분화되지 않은 상태로 돌아가는데 이때, PLD1의 mRNA와 protein의 발현이 감소되었다. 그리고, dominant negative PLD1의 transfection으로 8-Br-cAMP의 처리에 따른 형태적인 변화가 감소하였으며, PLD1의 transfection으로 8-Br-cAMP의 처리 없이도 형태적인 변화가 발생하였다. 그와 함께 PLD1의 siRNA transfection과 0.3% 1-butanol의 처리에 의해 prolactin과 IGFBP-1의 발현이 감소하였고 PLD1의 과발현으로 prolactin과 IGFBP-1의 발현이 증가하였다. 또한 phosphatic acid (PA)의 처리로 prolactin 발현과 형태적인 변화가 나타났으며 이는 PLD의 효소산물인 PA가 decidualization을 유발함을 나타낸다. 그리고 PLA2의 저해제인 mepacrine의 전처리에 의해 prolactin과 IGFBP-1의 발현과 형태적 변화가 감소하였으며, PAP의 저해제인 propranolol의 전처리는 영향이 없었다. 이 결과를 통해 PLD의 활성에 의해 형성된 PA가 PLA2를 거쳐 decidualization에 영향을 미침을 알 수 있었다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, PLD1은 PLA2를 경유하여서 8-Br-cAMP 에 의한 decidualization을 조절하며, PLD1의 upregulation이 자궁내막 기질세포의 decidualization에 필수적이라고 생각된다. 이상의 연구결과가 decidualization에 작용하는 PLD의 역할에 새로운 견해를 제시할 것으로 기대된다.; Using a primary cell culture system of human endometrial stromal cells (ES cells), we investigated the role of phospholipase D (PLD) in 8-Br-cAMP-induced decidualization, which is a morphological and biological differentiation process. When treated with 0.5 mM 8-Br-cAMP for 12 days, ES cells were transformed into a decidualized morphology and produced significant amounts of prolactin (PRL) and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP-1). Simultaneously, the activity and expression level of PLD1 increased also. In addition, removal of 8-Br-cAMP from decidualized ES cells restored the undifferentiated state, accompanied with a decrease of PLD1 promoter activity and PLD1 expression. Overexpression of dominant negative(DN)-PLD1 inhibited the morphological changes induced by 0.5 mM 8-Br-cAMP, whereas overexpression of PLD1 induced morphological changes in the absence of 0.5 mM 8-Br-cAMP treatment. Moreover, knockdown of PLD1 by siRNA and blockage of PLD by 0.3% 1-butanol treatment decreased PRL/IGFBP-1 expression, whereas overexpression of PLD1 increased PRL/IGFBP-1 expression. Treatment of ES cells with phosphatidic acid (PA) for 3 days induced PRL/IGFBP-1 expression and morphological change, implying that PA as an end product of PLD activation induced decidualization. In addition, pretreatment of ES cells with mepacrine decreased PRL/IGFBP-1 expression and morphological change, whereas pretreatment with propranolol did not change, compared to cAMP-treated cells, suggesting that PA induces decidualization through phospholipase A2 (PLA2). Taken together, these results suggest that PLD1 regulates 8-Br-cAMP-induced decidualization through PLA2, and that upregulation of PLD1 is essential for decidualization of ES cells.