Binding of Cdc42 to phospholipase D1 is important in neurite outgrowth of neural stem cell

Abstract

인지질 분해효소 D (Phospholipase D, PLD)는 세포막에 존재하는 인지질 말단의 phosphodiester bond를 가수분해하는 효소로서 세포의 증식, 분화를 비롯한 세포 내 다양한 활동을 매개하는 것으로 알려져 있다. 그 이전의 연구를 통해 PLD1의 발현과 PLD의 활성이 신경 줄기 세포가 분화하면서 neurite outgrowth가 일어날 때 증가함을 관찰하였다. 이에 본 연구에서는 임신 14일짜리 Rat의 배아의 대뇌피질로부터 분리된 신경 줄기 세포를 이용하여 신경 줄기세포의 분화 동안 Rho family GTPase가 PLD 활성 증가와 신경 줄기생장에 작용하는 역할을 규명하고자 하였다. 우선, 신경 줄기세포의 신경분화가 일어나는 동안 cdc42와 RhoA의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, Western blot과 immunocytochemistry를 통해 분화과정 동안 cdc42 와 PLD1은 주로 신경 줄기에 위치하며 RhoA는 cytosol에 위치하는 것을 관찰하였다. Coimmunoprecipitation을 이용하여 Cdc42와 PLD1이 신경분화 동안에만 결합하며, 이에 비해서 RhoA는 PLD1과 증식과 분화기 동안 모두 결합하는 것을 확인하였다. 신경 분화 과정 중에 Cdc42의 역할을 다시 확인하기 위해 Cdc42 dominant negative form인 Cdc42 N17과 Cdc42의 활성화 형태인 Cdc42 V12의 transfection을 실시하였다. 그 결과 Cdc42 N17의 transfectant는 PLD의 활성과 신경줄기의 길이가 감소하였으며, 이는 PLD1을 cotransfection한 결과 vector transfectant와 비슷한 수준까지 증가하였다. 이에 비해 Cdc42 V12 transfectant의 경우 PLD activity와 신경줄기의 길이가 모두 증가하였다. 이를 통해 Cdc42의 active state가 PLD의 활성 증가를 유발하고 이를 통해 neurite outgrowth에 중요하게 작용함을 알 수 있었다. 본 연구에서 얻어진 결과를 종합해 볼 때, 신경줄기세포의 분화 과정동안 Cdc42와 PLD의 상호 작용이 neurite outgrowth에 중요하게 작용하며 이는 Cdc42의 활성화 상태에 의존적인 것으로 생각된다. 이 연구결과가 신경 줄기세포의 분화과정에 작용하는 PLD의 역할에 새로운 견해를 제시할 것으로 기대된다.; We previously demonstrated that phospholipase D (PLD) expression and PLD activity are upregulated during neuronal differentiation. In present study, employing neural stem cells from the brain cortex of E14 rat embryos, we investigated the role of Rho family GTPases in PLD activation and in neurite outgrowth of neural stem cells during differentiation. As neuronal differentiation progressed, the expression levels of Cdc42 and RhoA increased. Furthermore, Cdc42 and PLD1 were mainly localized in neurite, whereas RhoA was localized in cytosol. Coimmunoprecipitation revealed that Cdc42 was bound to PLD1 during differentiation, whereas RhoA was associated with PLD1 during both proliferation and differentiation. These results indicate that the association between Cdc42 and PLD1 is related to neuronal differentiation. To examine the effect of Cdc42 on PLD activation and neurite outgrowth, we transfected dominant negative Cdc42 (Cdc42N17) and constitutively active Cdc42 (Cdc42V12) into neural stem cells, respectively. Overexpression of Cdc42N17 decreased both PLD activity and neurite outgrowth, whereas cotransfection with Cdc42N17 and PLD1 restored them. On the other hand, Cdc42V12 increased both PLD activity and neurite outgrowth, suggesting that active state of Cdc42 is important in upregulation of PLD activity which is responsible for the increase of neurite outgrowth.