탄저 치사요소 억제제 선별을 위한 Gal4전사 요소 절단 반응 분석을 통한 세포주 이용 활성 검정 시스템의 개발

Abstract

탄저병의 치사 독소인 lethal factor (LF)의 억제는 LF의 주된 활동 이 세포질 안에서 이루어 지기 때문에 탄저병의 효과적인 치료법의 개발이 최근의 주된 관심으로 부각 되고 있다. 여기서 우리는 선택적 배지 조건에서 Saccharomyces cerevisiae 을 이용하여 LF 에 의한 Gal4 transcription factor 의 절단 반응을 통한 β-galactosidase 의 활성 유무와 세포 조건 성장에 의한 LF의 억제를 증명하기 위해 cell-based high-throughput assay system을 설명하고자 한다. 이번 system에서는LF의 기질인 MEK1과 결합된 형태인 cGal4-MEK1 전사 인자가 yeast cell내의 reporter gene의 조절 유, 무로 알아볼 수 있다. 이러한 조건은 세포 성장에서 필수적인 histidine과 adenine이 결핍된 배지 조건 하에서 세포 성장 분화를 기본으로 한 전사 요소 결합 활성을 α 와 β-galactosidase의 발현 정량화를 통해 알아 볼 수 있다. 이 시스템에서는 yeast 세포 안에서LF의 발현과 함께 LF의 기질인 MEK1을 전사 요소 중 하나인 Gal4와 함께 발현되도록 조작함으로써 선택 배지에서의 세포 분화를 통해 LF의 억제 유, 무를 유도 할 수 있다. 이러한 성장 억제는 LF가 발현되는 세포 조건에서 LF 가수분해효소 후보 억제제를 선택 배지에 직접 투여함으로 인해서 cGal4-MEK1이 reporter gene을 조절하게 되고, α또는β-galactosidase 활성이 유도됨으로 인해 LF 억제제의 가능성을 입증 할 수 있게 된다. 본 연구에서는 두 단계의 선별 작업을 통한 6,500종의 화합물 중 유력한 탄저병 억제제를 선별 하였고, 화합물의 성분 분석과 치료제로써의 가능성을 제시 하였다. 이번 연구에서 선별된 화합물의 분자적 특징은 탄저병의 효과적인 치료제로 사용될 수 있다.; The inhibition of anthrax lethal factor (LF) is currently of interest as an effective therapeutics for the treatment of anthrax because LF plays major roles in cytotoxicity of target cells. Here, we describe a cell-based high-throughput format by Gal4 transcription factor cleavage assay in Saccharomyces cerevisiae for the identification of small molecule inhibitors of lethal factor by conditional growth and β-galactosidase activity in selective medium. In this system, chimeric Gal4 transcription factor harboring LF substrate (cGal4-MEK1) regulates reporter genes, which are essential for cell proliferation in the absence of histidines and adenine, and produce α- and β-galactosidase for the quantification of binding activity of the transcription factor. Co-expression of LF with the engineered cGal4-MEK1 in yeast cells results in site-specific cleavage and functional inactivation of cGal4-MEK1, leading to an inhibition of cell proliferation on selection medium. This growth arrest can be suppressed by the addition of potent LF protease inhibitors, of which inhibition potency can be validated from the α or β-galactosidase activity induced by cGal4-MEK1 controlled reporter genes. Using a two-stage screening, we presented a novel inhibitor screened from 6,500 representing scaffolds of libraries and analyzed pharmacophoric properties. The molecular scaffold of the compound may be used to design therapeutically novel inhibitors of LF.