인간 섬유아세포의 무혈청배지 개발을 위한 철 Chelator의 고찰

Abstract

현재 human embryonic stem cell 배양을 위한 이종 mouse fibroblast feeder layer 사용은 바이러스와 같은 병원체의 잠재적 감염의 위험이있기 때문에 무혈청배지 기반의 human fibroblast feeder layer 개발이 필요하다. 본 연구에서는 human fibroblast 의 무혈청배지 개발 중 배지 내 필수 성분인 철을 효율적으로 전달 할 수 있는 iron transport system 을 연구하였다. 철은 혈청에 있는 transferrin 단백질을 통해 세포에 효율적으로 전달되는 것으로 알려져 있는데 본 연구에서는 이를 대체 할 수 있는 철 착화제의 선정 및 최적 철 농도를 알아보았다. 먼저 무혈청배지 개발 시 transferrin 의 대체물로 사용되어지는 상용 iron-supplement 의 농도 조절 실험을 통하여 무혈청배지 개발 시 상용 iron-supplement 의 첨가 농도와 철의 첨가 범위를 알아보았다. 그 결과 고 농도(0.25~1ml/L) 의 상용 iron-supplement 의 첨가는 세포 성장에 저해 현상을 일으켰고 저 농도(0.1, 0.05ml/L) 의 상용 iron-supplement 첨가는 transferrin 10mg/L 를 첨가한 결과와 유사한 세포 성장을 보여 무혈청배지 개발 첨가 시 상용 iron-supplement 는 저 농도로 첨가해야 함이 확인되었다. 하지만 상용 iron-supplement 는 철의 농도만 알 수 있을 뿐 철의 종류와 그 외의 조성을 알 수 없는 혼합물이기 때문에 defined serum- free medium 을 개발하기 위해서는 조성이 알려진 대체 물질이 필요하다. 따라서 이를 대체하기 위하여 3가지 철 착화제(aurintricarboxylic acid(ATA), deferoxamine(DFO), ethylenediaminetetraacetic acid iron(Ⅲ) sodium salt(EDFS)) 를 선정하였고, 철의 첨가 종류를 확인하기 위하여 ferrous sulfate(Fe2+) 와 ferric chloride(Fe3+) 를 선정하여 농도별 실험을 하였다. 그 결과 철 첨가는 ferric 형태가 아닌 ferrous 형태로 첨가해야 함과 1.6μM 이상의 고 농의 철이 필요치 않음을 확인하였다. 또한 철 착화제와 함께 철 을 첨가한 것이 철만 첨가한 것 보다 세포 성장을 돕는 것을 알 수 있었으며 철 착화제에 따른 세포성장 비교 실험을 통하여 철만 첨가한 배지보다 37% 성장한 ATA 0.1mg/L(1.6μM Fe2+) 이 transferrin 대체 물질로 가능성이 있는 것으로 확인되었다.; Human embryonic stem cells are usually established and maintained on mouse fibroblast feeder layers. However, it is desirable to develop human feeder cells in serum-free medium because animal feeder cells have danger of infection of pathogen such as viruses. In this research, we studied about iron chelators that efficiently transport iron which is an essential component in cell growth for cells in human fibroblast's serum free medium. Iron is usually transported by transferrin in serum. In this study, we selected iron chelators that can replace transferrin for the xeno-free system and we observed the optimum iron concentration and sorts of iron. As a result, the addition of iron required ferrous form because addition of ferric form increased cell death. And iron also required low concentration. Finally, through of some iron chelator experiments, aurintricarboxylic acid confirmed by a possible material, replaceable for transferrin.