Enhancement of ectopic bone formation by bone morphogenetic protein-2 released from heparin-conjugated poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold

Abstract

골형성 단백질의 약물 전달은 뼈의 재생을 향상시킬 수 있다. 본 실험에서는 헤파린이 결합된 PLGA 지지체를 사용하여 골형성 단백질의 약물 전달 시스템을 개발하였고 골형성 단백질의 약물전달이 엑토픽 골형성을 향상시키는지 알 수 있었다. EDC의 존재하에 고분자 지지체의 말단에 있는 아민기와 헤파린의 반응으로 헤파린이 결합된 고분자 지지체를 얻을 수 있었다. 그리고 스타형 고분자 지지체에 결합된 헤파린의 양은 선형 고분자 지지체의 그것과 비교했을 때 3.2배가 결합되어 있었다. 고분자 지지체에 로딩된 골형성 단백질은 in vitro에서 최소 14일동안 방출되었다. 또한 골아세포의 배양으로 고분자 지지체로부터 방출되는 골형성 단백질의 생리활성도 조사하였다. 그 결과 헤파린이 결합된 고분자 지지체에서 방출된 골형성 단백질이 약 14일 동안 골아세포의 alkaline phosphatase 활성을 증가시켰다. 반면에 헤파린이 결합되지 않은 고분자 지지체에서 방출된 골형성 단백질은 처음 3일간만 ALP 활성을 증가시키고 그 후 감소하였다. 즉 헤파린이 결합된 고분자 지지체의 약물 전달 시스템은 오랜 기간 동안 골형성 단백질이 생리활성을 가지게 해 주었다. 헤파린이 결합된 고분자 지지체를 이용한 골형성 단백질의 in vivo에서의 골형성을 조사하기 위해 골형성 단백질이 로딩된 지지체를 쥐의 다리 근육에 이식하였고 골형성 단백질이 로딩되었으나 헤파린이 결합되지 않은 지지체와 로딩되지 않았으나 헤파린이 결합된 지지체를 대조군으로 하였다. 8주 후 조직학 분석을 통해 골형성을 조사하였고 그 결과 대조군에 비해 실험군에서 뼈가 많이 생성되었다. 실험군에서의 뼈 형성 면적과 칼슘 함유량은 뼈형성 단백질이 로딩되고 헤파린이 결합되지 않은 지지체 그룹에 비하여 각각 9배, 4배 더 높게 나타났다. 종전의 골형성 단백질의 약물 전달 시스템과 달리, 헤파린이 결합된 지지체를 사용한 골형성 단백질의 약물 전달 시스템은 오랜 기간 동안 전달이 가능하였고 고분자 지지체에 골형성 단백질을 로딩하는 과정에서 골형성 단백질의 활성에 해로운 유기용매의 사용을 피할 수 있었다. 따라서 골형성 단백질의 약물 전달은 골형성 단백질 투여가 골형성을 가능하게 함을 알 수 있었다.; Sustained delivery of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) could enhance bone regeneration. In this study, a heparin-conjugated poly(L-lactic-co-glycolic acid) (HP-PLGA) scaffold was developed for sustained delivery of BMP-2, and it was determined whether the sustained delivery of BMP-2 enhances ectopic bone formation. HP-PLGA scaffolds were prepared by using a coupling reaction between amino-terminated PLGA scaffolds and heparin in the presence of 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide. The amount of heparin conjugated to the PLGA scaffolds was increased up to 3.2-fold by using scaffolds made from star-shaped PLGA, as compared to scaffolds made from linear PLGA. The release of BMP-2 from HP-PLGA scaffold was sustained for at least 14 days in vitro. The bioactivity of BMP-2 released from HP-PLGA scaffold was accessed by using a calvarial osteoblast culture. BMP-2 released from HP-PLGA scaffold exhibited an increase in alkaline phosphatase (ALP) activity of osteoblasts for 14 days, whereas BMP-2 release from PLGA scaffold exhibited an increase in ALP activity for the first 3 days and decrease thereafter, suggesting that the delivery system of HP-PLGA scaffold can release BMP-2 in a bioactive form for a long period. To investigate the in vivo bone formation potential of BMP-2 delivery using HP-PLGA scaffold, BMP-2-loaded HP-PLGA scaffolds were implanted in ectopic sites of rats (n=8 per group). Implantation of both BMP-2-loaded PLGA scaffolds and unloaded HP-PLGA scaffolds served as controls. Eight weeks after implantation, histological analyses of the implants showed that bone formation was much higher in BMP-2-loaded HP-PLGA scaffold group than in both BMP-2-loaded PLGA scaffold group and unloaded HP-PLGA scaffold group. Bone formation area and calcium content were 9-fold and 4-fold higher, respectively, in the BMP-2-loaded HP-PLGA scaffold group than in the BMP-2 loaded PLGA scaffold group. Unlike BMP delivery systems developed previously, the BMP-2 delivery system using HP-PLGA scaffold exhibits long-term (at least 14 days) delivery and avoids the use of organic solvent in the process of BMP-2 loading to polymer scaffold, which may be detrimental to the BMP-2 activity. The sustained release of BMP-2 potentiates the osteogenic efficacy of BMP-2 administration.